Beschrijving van een methode om door toepassing van een ijzerpreparaat immunologisch belangrijke monocyten in het centrale zenuwstelsel zichtbaar te maken op een MRI. Die methode is beproefd en daarna toegepast om te bestuderen op welke manier monocyten door de bloed- hersenbarrière het centrale zenuwstelsel binnenkomen bij mensen met MS. De resultaten geven nieuwe mogelijkheden voor onderzoek naar oorzaak en behandeling van MS.

Samenvatting proefschrift Raoul Oude Engberink

c35proefschrift-080410-oudeEcoverHet onderzoek beschreven in dit proefschrift richt zich op de ontwikkeling van technieken voor de visualisatie van monocyten (immuuncellen) tijdens ontstekingsprocessen in de hersenen. Monocyten zijn verantwoordelijk voor weefselschade aan het centrale zenuwstelsel (CZS) in neurologische aandoeningen zoals multiple sclerose (MS). Het is van groot belang inzicht te krijgen waar en wanneer deze cellen het CZS binnenkomen tijdens de ziekte. Het blootleggen van dit schadelijke proces in MS zal uiteindelijk bijdragen aan de ontwikkeling van ontstekingsremmende medicijnen waarmee gericht en op het juiste moment ingegrepen kan worden.

Om deze cellen te visualiseren wordt er gebruik gemaakt van de techniek magnetic resonance imaging (MRI) en procedures om monocyten te labelen met specifieke MRI-contrastmiddelen. Het non-invasieve karakter van MRI maakt het mogelijk om de infiltratie van monocyten op verschillende plaatsen in het CZS en in de tijd te bestuderen.

De monocyt als ontstekingscel

MS is een aandoening van het CZS waarbij ontstekingen in de hersenen en het ruggenmerg resulteren in verlammingsverschijnselen. Onderzoek na autopsie van breinen van MS patiënten heeft uitgewezen dat op meerdere plekken de myelineschede is aangetast (demyelinisatie). Deze isolerende laag beschermt normaliter de uitlopers van zenuwcellen en is onmisbaar voor een goede geleiding van zenuwimpulsen. Demyelinisatie is het gevolg van een verstoring van het immuunsysteem waarbij bepaalde bestanddelen van het myeline als lichaamsvreemd worden beschouwd en afgebroken. Een aandoening waarbij het afweersysteem van het lichaam zich tegen lichaamseigen structuren richt, wordt een autoimmuunziekte genoemd.

Het is nog onbekend wat de autoimmuniteit in MS veroorzaakt, maar mogelijke factoren zijn van genetische aard of vinden hun oorsprong in virusinfecties. Het is wel aangetoond dat de aanwezigheid van witte bloedcellen, en voornamelijk monocyten en T-cellen, een grote rol speelt in deontwikkeling van deze ontstekingshaarden (laesies) in het CZS. In de laesies van MS patiënten zijn macrofagen (geactiveerde monocyten) aangetoond die afgebroken stukjes myeline bevatten. Dit benadrukt de rol van monocyten tijdens een ontsteking als ‘effectorcel’ die het weefsel schade berokkent.

Een belangrijke gebeurtenis tijdens de vorming van laesies in MS patiënten, is het binnendringen van monocyten in het CZS vanuit de bloedbaan. Hiertoe moeten monocyten een gespecialiseerde grenslaag van cellen oversteken, de bloed-hersen-barrière (BHB). In gezonde toestand voorkomt de BHB dat bepaalde bestanddelen uit de bloedcirculatie het CZS kunnen betreden. Tijdens MS is de BHB op verschillende plaatsen aangetast en kunnen cellen vanuit de bloedbaan het CZS binnendringen. Het bestuderen van monocyteninfiltratie levert belangrijke aanknopingspunten op voor het ontrafelen van het ontstekingsmechanisme. Zo is uit voorgaand onderzoek gebleken dat specifieke eiwitten (adhesiemolekulen) op de BHB het binnendringen van circulerende monocyten vergemakkelen. Tot op heden is informatie over de rol van monocyten voornamelijk gebaseerd op histologisch onderzoek. Het grote nadeel van dit soort onderzoek is dat het een momentopname op één locatie betreft van de ontsteking zonder duidelijkheid te verschaffen over het verloop. De migratie van monocyten is een dynamisch proces en om dit goed in kaart te brengen is de ontwikkeling van een non-invasieve visualisatie techniek van groot belang.

Doel van het onderzoek

  • Ontwikkeling en optimalisering van een labelingstechniek voor monocyten zodat deze cellen gedetecteerd kunnen worden met MRI.
  • Toepassing van deze strategie in een diermodel van MS om de migratie van monocyten tijdens het verloop van deze ziekte te bestuderen.

Beeldvorming op celniveau

In de kliniek wordt MRI voornamelijk gebruikt als beeldvormingstechniek om afwijkingen in de hersenen te detecteren op weefsel niveau. Zo kunnen bijvoorbeeld de laesies in de hersenen van MS patiënten worden opgespoord. De verantwoordelijke ontstekingscellen zijn echter onmogelijk waar te nemen met standaard MRI technieken.
Dankzij de recente ontwikkeling binnen het MRI onderzoek is het nu ook mogelijk om cellen met MRI te onderscheiden. Hierbij worden cellen gelabeld met ijzeroxide bevattende contrastmiddelen. Deze ijzerhoudende deeltjes worden ‘superparamagnetic particles of iron oxide’ (SPIO; als hun diameter groter is dan 50nm) genoemd of ‘ultra small SPIO’ (USPIO; diameter tot 50nm). Het binnenste van deze deeltjes is opgebouwd uit ijzeroxide molekulen die lokaal het magneetveld kunnen verstoren en daarmee het MRI signaal verlagen. Cellen die ijzeroxide deeltjes bevatten zullen daarom een signaalverandering veroorzaken en zichtbaar worden op een MRI- scan als donkere vlekjes.

Hoe je monocyten van een label kan voorzien

Om monocyten te visualiseren met MRI is het van belang dat de cellen de hierboven beschreven ijzerdeeltjes opnemen, een proces dat cellabeling wordt genoemd. Wij beschrijven een labelingsprocedure voor humane monocyten en bestuderen de labelingsefficiëntie van verschillende ijzeroxide deeltjes. Voor een optimaal MRI detectie niveau moeten monocyten zo efficiënt mogelijk gelabeld worden met ijzeroxide deeltjes zonder dat dit ten koste gaat van het ‘normale’ functioneren van de cel. In vitro MRI in combinatie met celkleuringen van de gelabelde monocyten toonden aan dat de labelingsefficiëntie met SPIO vele malen hoger ligt dan met USPIO. Een evenzo belangrijke bevinding is dat deze labelingsconditie geen nadelig effect heeft op (1) cel viabiliteit, (2) migratie capaciteit en (3) de activatie status van monocyten. Concluderend hebben we laten zien dat monocyten efficiënt gelabeld kunnen worden met ijzeroxide deeltjes zonder dat dit ten koste gaat van de fysiologische functie. Deze strategie biedt de mogelijkheid om de migratie van monocyten in vivo te bestuderen.

Visualisatie van monocyten in de hersenen

‘Proof of principle’

Om te testen of gelabelde monocyten in vivo gedetecteerd kunnen worden, hebben wij in eerste instantie gebruik gemaakt van ratten met een photothrombotisch (PT) herseninfarct. Dit diermodel van neuroinflammatie wordt gekenmerkt door een grote laesie in de cortex waarin een massale invasie van monocyten plaatsvindt. Deboven beschreven labelingsprocedure is hier toegepast om monocyten uit de rat te labelen met SPIO. Vervolgens zijn de SPIO-geladen monocyten intraveneus geïnjecteerd in PT ratten 5 dagen na laesie inductie. Een pre-injectie MRI scan van de ratten hersenen is gevolgd door scans 24 en 72 uur later. Pas 72 uur na injectie van gelabelde monocyten werd een duidelijke verlaging van signaalintensiteit in de corticale laesie waargenomen. Histologisch onderzoek naderhand wees uit dat het aangetaste stukje hersenen een aantal SPIO-geladen cellen bevatte. Een belangrijke boodschap van deze studie is dat we SPIO-geladen monocyten non-invasief met MRI kunnen detecteren zodra zij vanuit de bloedbaan de hersenen binnentreden.

Ex vivo versus in vivo labelingstrategie

Naast het terugspuiten van ex vivo gelabelde monocyten, zoals beschreven in de vorige paragraaf, is het ‘in vivo labelen’ een alternatieve strategie om monocyten activiteit te bestuderen met MRI. Hierbij worden ijzeroxide deeltjes (voornamelijk USPIO) direct in de bloedbaan gespoten waarna opname door circulerende monocyten kan plaatsvinden. Hoewel dit een aantrekkelijke labelingsprocedure lijkt, kleven er een aantal nadelen aan. De mogelijkheid bestaat dat de ijzerdeeltjes in ongebonden staat de laesie in lekken over een aangetaste BHB. Feitelijk verschaffen ze dan geen informatie over de migratie van cellen. Anderzijds bestaat het risico dat de partikels opgenomen worden door andere cellen. Tot op heden is er weinig bekend over acute USPIO kinetiek en in vivo opname in diermodellen van neuroinflammatie.

Daarom hebben wij deze in vivo labelingsmethode (USPIO injectie) rechtstreeks vergeleken met de ex vivo labelingsmethode (SPIO-geladen monocyten injectie) in PT ratten. Op MRI scans die elk half uur werden uitgevoerd na USPIO injectie ontdekten wij dat de signaalintensiteit in de corticale laesie al veranderde na 2 uur, wat duidt op lekkage van ijzeroxide deeltjes over de BHB. Dit in tegenstelling tot de bevindingen na de injectie van SPIO-gelabelde monocyten waarbij er pas na 72 uur ‘donkere vlekken’ in de laesie werden geregistreerd. De boodschap is tweeledig: (1) na intraveneuze toediening migreren SPIO-gelabelde monocyten naar een ontsteking in de hersenen en dit proces kan gevolgd worden met MRI. (2) Bij intraveneuze toediening van vrije USPIO moet rekening gehouden worden met een substantiële bijdrage van lekkende ijzeroxide partikels aan de verandering van het MRI signaal in ontstekingsgebieden. Dit laatste aspect is later nader bestudeerd in het licht van het MS diermodel.

Het niet kunnen volgen van gelabelde monocyten in een diermodel voor MS

Om de migratie van monocyten te bestuderen tijdens het ziekteverloop van MS hebben we vervolgens de befroefde labelingsstrategie toegepast in een diermodel voor MS, experimentele autoimmuun-encephalomyelitis (EAE). Op weefsel niveau wordt EAE gekenmerkt door BHB beschadigingen en de aanwezigheid van celinfiltraten in de hersenen welke resulteren in verlammingsverschijnselen. Zowel aan het begin van de ziekte als op de piek van de ziekte zijn in ratten met EAE monocyten geïnjecteerd die ex vivo gelabeld waren met SPIO. Op geen van de MRI scans die volgden in de tijd zijn gebieden met verlaagde signaalintensiteit waargenomen in de hersenen van deze EAE ratten. Een mogelijke verklaring voor de negatieve resultaten is de aanwezigheid van meerdere kleine laesies verspreid door het CZS in dit model (in vergelijking met één locale grotere laesie in PT ratten), waarover de gelabelde monocyten zich moeten verdelen. Dit houdt in dat mogelijk slechts enkele gelabelde monocyten zich ophopen in een klein ontstekingsgebied en als gevolg daarvan is de verandering in MRI signaal te klein om te detecteren. Waarschijnlijk is de efficiëntie van de toegepaste labeling strategie niet goed genoeg om monocyten infiltratie in het EAE model te bestuderen.

Verbeterde labelingstechniek

Om de monocyten effectiever te labelen en daarmee de MRI detectie limiet te verhogen hebben we een nieuwe labelingsstrategie voor monocyten toegepast: magneto-electroporatie (MEP). Deze techniek is gebaseerd op het gegeven dat een elektrische stroomstoot, die heel kort aan de cellen wordt gegeven, de celmembraan korte tijd doorlaatbaar maakt voor contrastmiddelen in het medium. Onze resultaten hebben uitgewezen dat met de juiste parameters (voltage, pulsduur) en het gebruik van kleine geladen ijzeroxide deeltjes, monocyten uit de rat binnen afzienbare tijd (milliseconden) gelabeld kunnen worden zonder de cel viabiliteit aan te tasten. Injectie van deze gelabelde monocyten in ratten met EAE resulteerde op de MRI scans, 24 en 72 uur later, in de aanwezigheid van kleine donkere vlekjes verspreid door het CZS. Kwantificeren van deze signaalafwijkingen liet zien dat er een duidelijke toename was na injectie tijdens de piek van de ziekte in vergelijking met injecties aan de start van de ziekteverschijnselen. De belangrijkste boodschap van deze studie is dat MEP een waardevolle labelingstechniek is en daarbij essentieel om de migratie van monocyten als dynamisch proces te visualiseren in neurologische aandoeningen met een diffuus laesie patroon, zoals in MS.

Injectie van vrije ijzeroxide deeltjes bij de rat

Uit eerder onderzoek naar USPIO injecties in ratten met EAE is gebleken dat deze partikels na 24 uur gedetecteerd worden in het CZS. De aanwezigheid van deze USPIO positieve gebieden correleerde met de activiteit van immuuncellen en laesievorming. Om MRI beelden na USPIO injecties juist te interpreteren is het van groot belang om de achterliggende USPIO dynamiek in vivo te bestuderen. Daartoe hebben wij gekeken naar USPIO effecten in het CZS van EAE ratten direct na injectie (0 – 6 uur) en op de langere termijn (24 en 72 uur). Hieruit kwamen een aantal belangrijke zaken aan het licht: (1) MRI scans direct na inspuiten lieten de donkere vlekken al 1 uur na USPIO injectie zien in het CZS en er werden grote overeenkomsten geconstateerd met Gd-DTPA lekkage, een conventionele MRI marker voor BHB schade. (2) Op MRI beelden 72 uur na injectie werd geen enkel USPIO effect meer in het CZS gedetecteerd, wat zou kunnen duiden op een afvoermechanisme van ijzeroxide partikels in de hersenen. (3) MRI van de cervicale lymfeklieren toonde een accumulatie van USPIO voornamelijk 72 uur na injectie aan de start van de ziekte. Uit eerder onderzoek is gebleken dat cervicale lymfeklieren een belangrijke rol spelen in het ontwikkelen van een auto-immuunreactie in EAE ratten en mogelijk ook in MS patiënten. Ons resultaat wijst erop dat USPIO in de hersenen mogelijk gedraineerd worden door de cervicale lymfeklieren en dat dit proces non-invasief gevolgd kan worden met MRI.

Samenvattend voor USPIO in de dierexperimentele setting kunnen we zeggen dat USPIO in de acute fase zich voornamelijk gedragen als marker voor BHB schade. Daarnaast zouden USPIO heel goed van pas kunnen komen om andere facetten in de MS pathogenese te bestuderen, zoals antigeen presentatie in lymfeklieren.

Van rat naar mens

Een groot voordeel van het gebruik van USPIO in het onderzoek naar neurologische aandoeningen is dat een aantal ijzeroxide deeltjes zijn goedgekeurd om aan mensen toe te dienen. Zo hebben wij recentelijk ontwikkelde en goedgekeurde USPIO intraveneus toegediend aan MS- patiënten en onderzoek gedaan naar de samenhang van USPIO-aankleuring en laesie ontwikkeling. Uit dit onderzoek is gebleken dat USPIO meer gebieden in hersenen van MS patiënten aankleurden dan het conventionele contrastmiddel Gd-DTPA. Een andere belangrijke ontdekking was dat de USPIO-aankleuringen in verschillende patronen verschenen die gedeeltelijk gecorreleerd konden worden aan het verdere verloop van de laesieontwikkeling. Uit deze studie komt duidelijk naar voren dat USPIO-MRI in MS-patiënten een waardevol instrument is om het ontstekingsmechanisme te onderzoeken. De toepassing ervan zou in de toekomst mogelijk ingezet kunnen worden als diagnose- en prognosetechniek.

Proefschrift: Magnetic Resonance Imaging of Monocyte Infiltration in an Animal Model of Multiple Sclerosis.
Promotores: Prof.dr.ir. M.A. Viergeveren Prof.dr. C.D. Dijkstra
Co-promotores: Dr. E.L.A. Blezer & Dr. H.E. de Vries

Curriculum Vitae

Personalia:

Naam:     Raoul Oude Engberink
Geboren: Leiden, 11 juni 1978

 Opleiding:
1990 – 1996 Erasmiaans Gymnasium Rotterdam

1996 – 2002 Scheikunde aan de Universiteit van Utrecht, Master of Science

2002 – 2003 Junior docent in het opleidingscentrum van scheikunde, UU

2003 – 2007 Promovendus aan het Image Sciences Institute, afdeling RRN, UMC Utrecht en de vakgroep Moleculaire Celbiologie en Immunologie, VU Medisch Centrum Amsterdam

 Werkervaring:
2000 – 2002 – Stage van 12 maanden bij de vakgroep Meloculaire Celbiologie en de vakgroep Biochemie aan de Universiteit Utrecht: Regulation of Radical Induced Response in the Cell Cycle;

Stage van 3 maanden bij de vakgroep Medicinal Chemistry: Binding affinities of Therapeutic Peptides;

Literatuurstudie bij de vakgroep Biochemie van Lipiden: Multiple Sclerosis; A Central Role for Lipids.

2002 – 2003 — Begeleiding synthese practica en van onderzoeksprojecten in het kader van Analytisch Chemisch Meten voor scheikunde studenten;

2006 — Onderzoeksproject van 6 weken aan het Johns Hopkins University School of Medicine, Maryland, Baltimore, USA;

2003 – 2007 — Promotieonderzoek, afgerond met proefschrift

66fproefschrift-080411-oude-engberink-pasfoto

Promotie:

24 april 2008, Universiteit Utrecht

Relatie met MS:

Na zijn studie Scheikunde aan de UU ging Raoul op zoek naar een vervolgtraject met een meer medische inslag. Dit promotieonderzoek bood hem de unieke kans om, binnen de faculteit geneeskunde, de techniek MRI te combineren met onderzoek naar cellulaire processen die ten grondslag liggen aan MS.