Verfijning ziektemodel in penseelaap

Om de oorzaak en het verloop van MS in detail te bestuderen, wordt de ziekte in diermodellen nagebootst, ook wel experimentele autoimmuunencefalomyelitis (EAEexperimental autoimmune encephalomyelitis= experimentele auto-immuunontsteking van de myeline in de hersenen, het diermodel van MS. Meer...) genoemd. Vaak gebeurt dit in knaagdieren waarbij er twijfel blijft of dit model wel geschikt is voor onderzoek naar MS bij de mens. Anwar deed onderzoek bij EAE van de common marmoset, ofwel de penseelaap. Hij verfijnde het diermodel in de penseelaap zodanig dat het vergelijkbaar is met MS en kan worden gebruikt als een relevant model voor fundamenteel en toegepast onderzoek.

Samenvatting proefschrift Sunil Anwar Jagessar 

Multiple sclerose (MS) is een neurologische aandoening die zich kenmerkt door onder andere slecht zien, coördinatieverlies en verlammingen van ledematen. Deze symptomen worden hoogst waarschijnlijk veroorzaakt door ontstekingen en demyelinisatie van de witte en grijze stofDe gebieden in de hersenen die met zenuwcellen gevuld zijn. Deze gebieden zien er grijs uit als je de hersenen doorsnijdt en bekijkt. Meer... in de hersenen en het ruggenmerg. Men denkt dat MS een autoimmuunziekte is, waarbij het immuunsysteem reageert op het eigen lichaam, in dit geval tegen componenten van de myelineschede rondom de zenuwcellen.

Echter, voor dit onderzoek is de common marmoset, ofwel de penseelaap, gebruikt. De penseelaap is een niet-humane primaat en lijkt immunologisch en genetischErfelijk, de erfelijkheid betreffend. Meer... gezien veel op de mens. Bovendien komen het ziekteverloop en andere karakteristieke symptomen van EAE bij de penseelaap sterk overeen met MS, en maakt het model geschikt voor validatie van nieuwe therapieën.

Doel van het onderzoek

Aan het begin van het in dit proefschrift beschreven onderzoek was er weinig bekend over de kritische immunologische factoren in het EAE model in de penseelaap. De toen beschikbare EAE modellen in de penseelaap, namelijk actieve inductie met recombinant humaan myelineVetachtige, witte stof die in de vorm van de zogenaamde myelineschede de zenuwvezels isolerend omhult. De myeline draagt bij tot een efficiënte zenuwgeleiding; bij myelinebeschadiging, zoals bij MS, loopt de zenuwgeleiding mank of is ze zelfs afwezig. Dit kan leiden tot diverse symptomen. Meer... oligodendrociet glycoproteine (rhMOG) of myeline basaal eiwiteen chemische stof, die is opgebouwd uit een aaneenschakeling van kleine moleculen (aminozuren. Die bevatten als kenmerk alle stikstof. Van die aminozuren zijn er 20 verschillende. De volgorde waarin ze aan elkaar geknoopt worden is geregeld vanuit de kernen van de cellen volgens een daarin opgeslagen vaste volgorde van 4 stoffen, de 'basen'. De volgorde waarin de basen aan elkaar geknoopt zijn is dus bepalend voor de samenstelling van een eiwit. Zo'n streng basen vormt samen een molecuul DNA. Het bevindt zich in één van de kernlissen in de kern -zie chromosomen. Een hoofdtaak van eiwitten is het regelen van de stofwisseling - zie enzymen. Eiwitten kunnen ook dienen als bouwmateriaal voor het lichaam. Ze maken dan onderdeel uit van de stofwisseling. Meer... (MBP) gemengd met compleet Freund’s adjuvant (CFA), met wel of zonder toediening van Bordetella bacterie deeltjes, gaf een acute reactie die nauwelijks vergelijkbaar was met MS.

Het belangrijkste doel van dit proefschrift was om de klinische en immunologische kenmerken van MS in de penseelaap na te bootsen door kunstmatige benodigdheden te minimaliseren, zoals mycobacteriën die verantwoordelijk zijn voor ernstige ongemakken voor het dier. Tegelijkertijd is de rol van witte bloedcellen, namelijk van autoreactieve T- en B-cellen onderzocht tijdens de ziekte, en werden nieuwe therapieën voor MS bestudeerd om meer inzicht te verkrijgen in de mechanistische routes.

MOG

Uit eerdere studies in MS patiënten en diermodellen is gebleken dat myeline eiwitten een centrale rol spelen in het ziekteproces. We hebben het vermogen om ziekte te induceren van een enkel myeline eiwit, namelijk MOG onderzocht. Het interessante van MOG is dat het maar een klein deel uitmaakt van de myeline samenstelling en dat het tot expressie komt aan het oppervlak van de myelineschede. Penseelapen geïmmuniseerd met myeline afkomstig van wild-type C57BL/6 muizen ontwikkelden EAE symptomen, terwijl penseelapen die met myeline van MOG-deficiënte C57BL/6 muizen werden ingespoten slechts milde klinische symptomen en milde hersen- en ruggenmergschade ontwikkelden. Deze resultaten leidden tot de conclusie dat MOG overbodig is voor ziekte-inductie, maar een cruciale rol speelt in het verdere beloop van de ziekte.

De rol van MOG

Om de pathogene rol van MOG in meer detail te besturen, zijn penseelapen met recombinant humaan MOG in CFA geïmmuniseerd. Dit resulteerde in 100% ziekte-incidentie met een heterogeen ziekteverloop. De heterogeniteit kon toegeschreven worden aan het feit dat elk dier genetisch verschillend is, net als de mens. Dieren die relatief snel ziekte ontwikkelden toonden een brede T-cel reactie gericht tegen epitopen van MOG, met name tegen 34-56 en de overlappende peptiden 64-86 en 74-96. Immunisatie met MOG34-56 in CFA leidde tot een chronisch ziektebeeld dat zich kenmerkte door ontstekingen en demyelinisatie. Bovendien werden activatie van MOG34-56 autoreactieve T-cellen gezien als de boosdoeners in dit model. Deze MOG34-56 autoreactive T-cellen konden op basis van hun fenotype en cytotoxiteit toegewezen worden als mogelijke natural killer – cytotoxische T-cellen (NK-CTL).

In tegenstelling tot MOG34-56 in CFA immunisatie, bleven ziekteverschijnselen in penseelapen geïmmuniseerd met MOG74-96 in CFA uit. Echter, een enkele booster-immunisatie met MOG34-56 in incomplete Freund’s adjuvant (IFA) leidde tot neurologische symptomen binnen een paar weken. Op basis van deze resultaten veronderstelden wij dat immunisatie met MOG34-56 in IFA voldoende zou moeten zijn voor ziekte-inductie. IFA bevat alleen minerale olie en geen mycobacteriën en onderscheidt zich hiermee van CFA.

Immunisering met het stukje MOG 34-56

Vervolgens hebben we aangetoond dat immunisatie met MOG34-56 in IFA daadwerkelijk leidde tot chronische EAE in de geïmmuniseerde dieren. Daarnaast was de pathologie en activatie van de autoreactieve T-cellen vergelijkbaar met de rhMOG in CFA en MOG34-56 in CFA EAE modellen. Interessant genoeg werd in de MOG34 in IFA model alleen antilichamen gevormd tegen de MOG epitopen 24-46 en 34-56, maar niet tegen rhMOG. Hieruit concludeerden wij dat de ziekteactiviteit door MOG34-56 autoreactieve T-cellen wordt veroorzaakt. Bovendien is dit model zonder CFA een belangrijke verfijning voor zowel het dier, door het ontbreken van granulomavorming op de injectieplaatsen, als op conceptueel gebied.

Mechanisme en aard van de voor MOG 34-56 gevoelige cellen

We hebben gebruik gemaakt van verschillende immunologische testen om het mechanisme en de aard van de MOG 34-56 autoreactive T-cellen te ontrafelen. Hier kwam uit voort dat de meeste delende T-cellen zich in de secundaire lymfeklieren bevinden, zoals de milt, en niet in het bloed. Deze cellen maakten veel van de cytokine IL-17A aan en werden gekarakteriseerd door specifieke cytotoxische capaciteit. In de cytotoxiteit proeven bleek dat deze T-cellen een peptide van 9 aminozuren lang herkennen binnen de MOG34-56 sequentie, te weten MOG40-48. Het MOG40-48 peptide werd gepresenteerd door het MHC klasse I molecuul Caja-E, dat equivalent is aan HLA-E in de mens. Al deze eigenschappen duidden erop dat deze MOG34-56 autoreactive T-cellen NK-CTL-achtige zijn.

Bevestiging dat MOG 34-56 bruikbare EAE veroorzaakt

In een laatste experiment van het verfijningsproces van het EAE model in de penseelaap, zijn in hoofdstuk 6 de dieren met rhMOG in IFA geïmmuniseerd. Alle dieren ontwikkelden klinische verschijnselen, grijze en witte stofEen in de biochemie vóórkomende natuurlijke en scherp te onderkennen en te beschrijven chemische stof, bijvoorbeeld het aminozuur alanine (C3NO2H8), glucose (C6O6H12) als bestanddeel van glycogeen enz. enz. Meer... laesies in de hersenen, en antilichamen tegen rhMOG en de MOG peptiden 14-36, 24-46, 54-76, maar niet tegen 34-56. Aangezien de immunologische analyse op het moment van schrijven incompleet was, kan nog niet worden vastgesteld in welke mate het model vergelijkbaar is met de andere EAE modellen in de penseelaap, en of het gebruikt kan worden als een preklinisch model voor therapieën die gericht zijn tegen B- en/of T-cellen.

De rol van B-cellen

We hebbenonderzocht in welke opzichten B-cellen bijdragen aan de ziekte in het T-cel gemedieerde MOG34-56 in IFA model. Hier werd één helft van vijf tweelingen behandeld met een anti-CD20 antistof dat B-cellen verwijdert, en de ander helft werd behandeld met fysiologisch zout. De anti-CD20 behandeling resulteerde in 100% verwijdering van B-cellen uit bloed en de milt, en onderdrukking van klinische en pathologische EAE symptomen. Dit leidde tot de veronderstelling dat B-cellen direct betrokken zijn bij de activatie van de pathogene autoreactieve T-cellen.

Onlangs hebben anti-CD20 studies bewezen effectief te zijn in MS patiënten, maar het bleek dat langdurige verwijdering van de B-cellen in andere autoimmuunziekten kan leiden tot ernstige bijwerkingen, zoals het ontwikkelen van meerdere laesies in de hersenen.

Alternatieve verwijdering van B-cellen

We hebben daarom gekozen voor een alternatieve benadering van B-celeen bepaald soort witte bloedcel. B-cellen zijn cellen van het immuunsysteem die als taak het maken van antilichamen hebben. Deze antilichamen kunnen binden aan het antigen dat ze herkennen en deze zo onschadelijk maken. Meer... verwijdering, te weten met antistoffen tegen B-Lymfocyten Stimulator (BLyS) en Een Proliferatie-Inducerende Ligand (APRIL). Deze twee antistoffen zijn in staat moleculen te inactiveren die betrokken zijn bij B-cel overleving. Behandeling met anti-BLyS en anti-APRIL hebben het begin van de ziekte aanzienlijk vertraagd en hadden ook een positief effect op de pathologie in het ruggenmerg. Immunologische parameters gaven aan dat antistoffen tegen rhMOG en MOG peptiden gereduceerd waren, en er was een verminderde activiteit van Th1 (IFN-) en Th17 (IL-17A) gerelateerde cytokinen na de anti-BLyS behandeling. De anti-APRIL behandeling leidde tot een afname van de mRNA transcripten van Th1 en Th17 gerelateerde cytokinen, en tot een verhoogd mRNA transcript niveau van de regulerende cytokine IL-10. Deze waarnemingen suggereren dat het T-cel activiteitsprofiel door de behandeling met anti-APRIL is verschoven van een pro- naar een anti-ontstekingsreactie.

De rol van Th17 cellen

Zoals eerder is aangegeven, wordt de kern van de ziekte in de MOG34-56 in IFA model toegewezen aan de activatie van NK-CTL en Th17 cellen. We hebben een mogelijke rol van Th1 cellen onderzocht in het Th17 gemedieerde ziektemodel. Penseelapen die met MOG34-56 in IFA waren geïmmuniseerd, hebben een profylactische en therapeutische behandeling ondergaan met recombinant humaan IFN-. Hieruit bleek dat de behandeling geen positief effect had op de klinische symptomen, maar er was verandering opgetreden in B- en T-cel reacties. Deze resultaten droegen bij aan de speculatie dat productie van IL-17A door cytotoxische T-cellen niet wordt beïnvloed en dat Th1 cellen een ondergeschikte rol spelen in het MOG34-56/IFA model.

Discussie

Tenslotte bediscussiëren we de belangrijkste bevindingen, met name hoe deze resultaten kunnen bijdragen aan een beter begrip van het immuunpathogene mechanisme van EAE in de penseelaap. Afsluitend kunnen we zeggen dat het diermodel voor MS in de penseelaap zodanig is verfijnd dat het vergelijkbaar is met MS, en kan worden gebruikt als een relevant model voor fundamenteel en toegepast onderzoek. Echter, verder onderzoek is vereist om de exacte mechanismen te ontrafelen en verbeterde MS therapieën te ontwikkelen.

Proefschrift: Mechanistic Refinement of the common Marmoset Model for MS
Promotoren: prof.dr. J.D. Laman; prof.dr. B.A. ’t Hart