Astrocyten op de barricade

Samenvatting proefschrift Mark R. Mizee

proefschrift-130913-mizeecoverMultiple sclerose (MS) is een chronische aandoening van het brein en ruggenmerg, die samen het centraal zenuwstelsel (CZS) vormen. Tijdens de relapsing-remitting fase van de ziekte vinden er in het gehele CZS ontstekingen plaats waarbij de isolatielaag van zenuwcellen, myeline genaamd, wordt afgebroken door cellen van het eigen immuunsysteem. Deze onstekingsgebieden, de laesies, worden gekenmerkt door een slecht functionerende bloed-hersen barrière (BHB).

De BHB zorgt normaal gesproken voor het afschermen van de hersenen tegen cellen en stoffen uit de bloedcirculatie die schadelijk zijn voor het CZS. De veranderde BHB functie heeft tot gevolg dat er een grote toestroom van witte bloedcellen in het CZS mogelijk is. Deze witte bloedcellen vallen hierop het CZS aan wat leidt tot de afbraak van myeline en schade aan de zenuwcellen. Na verloop van tijd verdwijnt de ontsteking en blijft er littekenweefsel over (sclerose). De rol van de bloed-hersen barrière in het ziekteproces van MS is belangrijk omdat het de toegangspoort is voor het immuunsysteem tot de hersenen.

Wanneer we beter begrijpen waarom de BHB in MS niet langer functioneert zoals in een gezond brein, en hoe we dit proces kunnen beïnvloeden, zijn we een stap dichterbij het controleren van het ziekteverloop in MS. Dit is belangrijk om in een vroeg stadium van MS de schade zoveel mogelijk te kunnen beperken.

In deze Nederlandse samenvatting wordt een introductie gegeven van het veld waarbinnen dit proefschrift tot stand is gekomen en worden de belangrijkste bevindingen van het proefschrift besproken. Vervolgens wordt in het kort besproken welke conclusies getrokken kunnen worden op basis van dit proefschrift.

De bloed-hersen barrière.

De BHB vormt de grens tussen de bloedcirculatie en het hersenweefsel en wordt gevormd door gespecialiseerde endotheelcellen. Deze cellen vormen samen een structuur aan de binnenkant van de bloedvaten die in continu contact is met de bloedstroom. De observatie dat er een selectieve barrière bestaat tussen het CZS en de bloed circulatie is al meer dan honderd jaar oud. Deze ontdekking werd gedaan doordat geïnjecteerde kleurstoffen in muizen door het hele lichaam waren terug te vinden, behalve in de hersenen.

Vice versa konden kleurstoffen die in de hersenen werden ingespoten niet ergens anders in het lichaam worden teruggevonden. Sinds door elektronenmicroscopie duidelijk werd dat niet de hersencellen, maar de endotheelcellen deze barrière vormen, is het onderzoek zich gaan richten op het hersenendotheel en de interactie van deze cellen met de cellen van het CZS. Hersenendotheelcellen onderscheiden zich van endotheelcellen in de rest van het lichaam doordat ze minder doorlaatbaar zijn. Dit komt onder andere door de aanwezigheid van zogenaamde tight junction (TJ) eiwitten die een soort ritssluiting tussen endotheelcellen vormen en zo zorgen voor een structurele afscherming van de hersenen tegen cellen en moleculen in het bloed.

Hersenendotheelcellen beschikken daarnaast over een breed scala aan transporteiwitten die niet alleen zorgen voor de selectieve opname van belangrijke voedingsstoffen uit het bloed, maar ook alle voor het CZS schadelijke stoffen terug de bloedbaan in kunnen pompen. Voor een schematische weergave van de BHB, zie figuur1. Alle specifieke eigenschappen van de BHB zorgen gezamenlijk voor het in stand houden van een optimaal milieu in het CZS, de zogenaamde homeostase. Deze homeostase is cruciaal voor het normaal functioneren van de zenuwcellen in ons brein.

Onder invloed van de verschillende onstekingsprocessen die plaats vinden in MS laesies lijdt de BHB schade en dragen de endotheelcellen bij aan het verergeren van de ontsteking. Zo is de BHB minder goed in staat om lekkage van schadelijke bloedcomponenten te voorkomen en is de aanwezigheid en functie van transporteiwitten verminderd. Daarnaast brengen de endotheelcellen adhesiemoleculen zoals VCAM en ICAM aan op hun celwand, waardoor cellen van het immuunsysteem zich vast kunnen grijpen aan de bloedvatwand, e zo makkelijker het CZS binnenkomen. Ook scheiden de endotheelcellen zelf ontstekingssignalen uit die kunnen worden opgepikt door naburige hersencellen. De immuuncellen zelf zorgen door middel van onder andere zuurstofradicalen en andere toxische stoffen voor het openen van de BHB. Aangezien het verlies van BHB functie al in een vroeg stadium van laesie ontwikkeling optreedt, zal dit leiden tot een verlies van homeostase waardoor een toxisch milieu ontstaat voor de cellen van het CZS. Dit leidt vervolgens tot een verergering van de ontsteking.

Figuur 1. Een schematische weergave van de bloed-hersen barrière.

proefschrift-130913-mizee-figuur1

In dit figuur zien we de hersenendotheelcellen (E) die samen het bloedvat vormen (B). De endotheelcellen zijn sterk met elkaar verbonden door tight junction eiwitten en beschikken over transporteiwitten voor de opname van voedingsstoffen en het uitscheiden van schadelijk stoffen. Aan de CZS kant van het hersenendotheel vinden we de astrocyten (A) die met hun eindvoeten contact maken met het hersenendotheel en ook met andere astrocyten in contact staan. Rechtsboven is de microscopische opname te zien die op de kaft van dit proefschrift staat. We zien hier de astrocyten (rood) die met hun eindvoeten contact maken met een bloedvat (groen) van een rat.

Ontwikkeling van de bloed-hersen barrière.

Waarom hersenendotheelcellen verschillen van endotheelcellen elders in het lichaam is nog niet geheel duidelijk. Wel is al sinds geruime tijd bekend dat de omgeving waarin deze hersenendotheelcellen zich bevinden, het CZS, een cruciale rol speelt bij het vormen en onderhouden van de BHB. Een klassiek experiment dat dit concept liet zien was het transplanteren van niet-CZS weefsel in het embryonale brein. De bloedvaten die vanuit het transplantaat het ontwikkelende brein ingroeiden lieten eigenschappen van de BHB zien. Andersom lieten deze experimenten ook zien dat wanneer hersenweefsel werd getransplanteerd naar de huid, de vaten die vanuit het transplantaat groeiden hun BHB-eigenschappen verloren. Dit geeft aan dat hersenendotheelcellen bepaalde signalen vanuit het CZS nodig hebben om de BHB te kunnen vormen.

Een aantal van die signalen uit de omgeving zijn recentelijk beschreven en zijn afkomstig van voorlopercellen in het embryonale CZS. Deze cellen zullen zich uiteindelijk ontwikkelen tot astrocyten, de stervormige steuncellen van de hersenen, en neuronen, de zenuwcellen die informatieoverdracht mogelijk maken. De voorlopercellen van astrocyten, radiale gliacellen, zijn ook belangrijk voor de signalen aan neuronale voorlopercellen om neuronen te worden. Eén van die signalen is het molecuul retinolzuur, afkomstig van vitamine A. Aangezien de vasculaire en neuronale ontwikkeling bepaalde signalen delen, hebben wij gekeken naar het effect van retinolzuur op de ontwikkeling van de BHB. We hebben gevonden dat retinolzuur, dat wordt geproduceerd door radiale gliacellen, de BHB versterkt. Zo zorgt retinolzuur niet alleen voor een betere fysieke barrière door het beïnvloeden van TJ-eiwitten, maar heeft het ook invloed op de aanwezigheid van belangrijke transporteiwitten.

Verdere experimenten leerden ons dat een bepaalde retinolzuur receptor, RARβ, de belangrijkste receptor lijkt te zijn voor het verwerken van het retinolzuur signaal. We hebben daarom gekeken naar de aanwezigheid van deze receptor tijdens humane hersenontwikkeling met behulp van immunohistochemie. We hebben laten zien dat deze receptor tijdens een bepaalde ontwikkelingsperiode aanwezig is in de endotheelcellen van het CZS, wat aangeeft dat deze cellen op dat moment ontvankelijk zijn voor retinolzuur. Door het inactiveren van de retinolzuurreceptoren tijdens de embryonale ontwikkeling van muizen konden we zien dat de BHB in deze muizen niet goed ontwikkeld was. Zo was de BHB in deze muizen niet in staat om lekkage van eiwitten vanuit de bloedbaan tegen te gaan en waren belangrijke BHB-eiwitten niet voldoende aanwezig.

Deze bevindingen staan beschreven in hoofdstuk 2 en geven aan dat retinolzuur een belangrijk signaal is tijdens de vorming van de BHB. Het vinden van lichaamseigen signalen die BHB formatie ondersteunen kan belangrijk zijn in de zoektocht naar manieren om de beschadigde BHB te repareren. Een interessant gegeven hierbij is de mogelijkheid dat de endotheelcellen van de BHB tijdens ontstekingen in het CZS hun specifieke eigenschappen verliezen en meer gaan lijken op niet-CZS endotheel. Een aanwijzing hiervoor staat beschreven in hoofdstuk 3. Hier we beschrijven we dat het eiwit PLVAP, dat normaal gesproken niet aanwezig is op hersenendotheel maar wel op alle andere endotheelcellen in het lichaam, alleen terug te vinden is op BHB-endotheel dat zich bevindt in een gebied waar een ontsteking gaande is. Hoewel deze bevindingen zijn gedaan in het diermodel voor MS, experimentele autoimmuun encephalomyelitis (EAE), zijn soortgelijke bevindingen ook gedaan door anderen in humane hersenaandoeningen. Het verliezen van deze BHB-specifieke eigenschappen in hersenendotheel kan betekenen dat signalen die normaal gesproken alleen aanwezig zijn tijdens de ontwikkeling een belangrijke bijdrage kunnen leveren tijdens het herstel van de barrière tijdens MS.

Astrocyten en de bloed-hersen barrière in MS, een dubbele rol

De rol van astrocyten bij de BHB tijdens ontstekingen in het brein is al door velen uitgebreid onderzocht. Dit komt met name door de belangrijke rol die astrocyten vervullen bij de totstandkoming en onderhoud van de BHB. Astrocyten staan in continu contact met de bloedvaten in de hersenen door middel van vele uitlopers, ook wel eindvoetjes genoemd (zie figuur 1). Wanneer men astrocyten plotseling weg zou halen leidt dit tot een snelle achteruitgang van de barrièrefuncties van de BHB.

Naast deze cruciale rol in BHB onderhoud communiceren ze ook met alle andere cellen van het CZS en met naburige astrocyten. Hierdoor kunnen astrocyten snel reageren op veranderingen in de omgeving zoals een ontsteking in MS laesies. Tijdens de vorming van een MS laesie reageren astrocyten op ontstekingssignalen van zowel CZS cellen als geïnfiltreerde cellen van het immuunsysteem. Dit leidt tot een reactie van de aanwezige astrocyten, op dat moment reactieve astrocyten genoemd. In hoofdstuk 4 en 5 hebben we gekeken naar de veranderingen in de interactie tussen endotheelcellen en reactieve astrocyten tijdens MS.

In hoofdstuk 4 hebben we gekeken naar de aanwezigheid van 4 belangrijke BHB transporteiwitten die betrokken zijn bij het uitscheiden van schadelijke stoffen naar de bloedbaan in MS laesies. Uit deze studie en eerder werk uit onze groep bleek P-gp het enige transporteiwit te zijn dat minder aanwezig was in MS laesies. Wel zagen we dat drie transport eiwitten (P-gp, MRP1 en MRP2) verhoogd aanwezig waren op reactieve astrocyten. Door het nabootsen van reactieve astrocyten en het isoleren van astrocyten uit MS laesies hebben we laten zien dat deze transport eiwitten betrokken zijn bij het uitscheiden van een signaalmolecuul dat de ontsteking bevordert, CCL2. Dit molecuul zorgt er niet alleen voor dat er meer immuuncellen naar een ontsteking worden geloodst, maar kan ook directe negatieve gevolgen hebben op de barrièrefunctie van de BHB.

Het blokkeren van deze transporteiwitten had dan ook tot gevolg dat reactieve astrocyten minder in staat waren om immuuncellen aan te zetten tot het passeren van de BHB. Hieruit kunnen we afleiden dat het dempen van de reactie van astrocyten op ontsteking zou kunnen helpen om BHB schade in MS laesies te beperken. We weten echter uit studies in het EAE model dat het belemmeren van de reactieve astrocyten juist zorgt voor meer schade in de laesies. Er lijkt dus ook een beschermende rol te zijn voor reactieve astrocyten in MS laesies die niet over het hoofd gezien mag worden.

Recent onderzoek heeft aangetoond dat bepaalde signalen die belangrijk zijn tijdens de totstandkoming van de BHB ook kunnen fungeren als beschermende en ontstekingsremmende signalen tijden BHB schade en ontsteking. Wij hebben daarom gekeken naar de aanwezigheid van de retinolzuur signaleringsroute in MS laesies. We laten in hoofdstuk 5 zien dat het enzym dat retinolzuur produceert, RALDH, in hoge mate aanwezig is in reactieve astrocyten in MS laesies. Dit zou kunnen duiden op de productie van retinolzuur door reactieve astrocyten. Wanneer we astrocyten blootstellen aan inflammatoire stoffen zien we dat deze cellen in staat zijn om retinolzuur te produceren en uit te scheiden.

Vervolgens hebben we gekeken naar de effecten van retinolzuur op BHB schade door ontsteking. Retinolzuur bleek in staat te zijn om veel van de schadelijke effecten van ontsteking op BHB endotheel cellen ongedaan te maken, of te verminderen. Hieronder vallen onder meer het verlies van barrière functie, de aanwezigheid van adhesiemoleculen en de verhoogde aanwezigheid van schadelijke zuurstofradicalen. Uit deze studie blijkt dus dat reactieve astrocyten retinolzuur kunnen produceren dat de BHB kan beschermen tegen de schadelijke gevolgen van ontsteking. Naast ontstekingsremmende effecten op endotheelcellen zijn dergelijke effecten van retinolzuur ook beschreven op andere cellen van het CZS, waaronder astrocyten zelf. Verder onderzoek zal moeten wijzen of het beïnvloeden van de retinolzuur-route in MS van therapeutische waarde zou kunnen zijn.

Conclusie

Uit de bevindingen die zijn opgenomen in dit proefschrift kunnen we concluderen dat de ontwikkeling van de BHB afhankelijk is van retinolzuur, een molecuul dat wordt geproduceerd door de voorlopercellen van astrocyten. Tijdens de ontsteking die plaats vindt in MS laesies worden astrocyten reactief en dragen actief bij aan het ontstekingsproces door maken en uitscheiden van voor de BHB schadelijke stoffen. Deze reactieve astrocyten vervullen echter ook een beschermende rol door de productie van het ontstekingsremmende retinolzuur.

Dit laatste laat ook zien dat onderzoek naar de ontwikkeling van de BHB kan bijdragen aan het vinden van nieuwe beschermende strategieën in MS. We komen steeds meer te weten over de rol van reactieve astrocyten in MS en hun relatie met de BHB. Wanneer we beter kunnen begrijpen hoe we de negatieve aspecten van reactieve astrocyten kunnen aanpakken en de positieve aspecten kunnen bevorderen, kunnen deze cellen in de toekomst mogelijk als therapeutisch doelwit gebruikt worden.

Proefschrift: Regulation of the blood-brain barrier in health and disease. Astrocytes at the barricade
Promotoren: prof.dr. C.D. Dijkstra en prof.dr. H.E. de Vries
Co-promotor: dr. A. Reijerkerk
Dit onderzoek is gefinancierd door MS Research

Curriculum Vitae

Personalia:

Naam:     Mark R. Mizee
Geboren: Soest, 26 december 1983

 Opleiding:

2002 Gymnasium  Jeroen Bosch College, Den Bosch

2006 Biomedische Wetenschappen UU; bachelor

2008 Clinical and Exp. Neuroscience UU, master

Twee stages bij de UVA en de VU en een scriptie met als titel: MS and endothelial cell-astrocyte interactions at the blood/brain barrier

 Werkervaring:

2008-2012: Promovendus afd. Moleculaire Celbiologie en Immunologie VUmc Amsterdam

2013 Post-doc afd. Moleculaire Celbiologie en Immunologie VUmc Amsterdam.

proefschrift-130913-mizeeportret

Promotie:

13 september 2013 Medische Faculteit VU Amsterdam

Relatie met MS:

Toen ik begon met mijn promotieonderzoek was ik vooral geinteresseerd in de fundamentele kant van het onderzoek naar hersenziekten.

In mijn omgeving was er ook niemand die aan MS leed. In de afgelopen 4 jaar ben ik door mijn onderzoek in contact gekomen met veel MS patienten, ook in mijn eigen omgeving. Dit heeft voor mij wel extra diepgang in mijn onderzoek opgeleverd, en daarmee een extra motivatie om er mee door te gaan.