Onderzoek  naar de verschillende types van gliacellen, die voor het immuunsysteem in het centrale zenuwstelsel verantwoordelijk zijn (microgliafenotypes). Ze  spelen een rol bij de handhaving van stabiliteit (de homeostase) in het centrale zenuwstelsel.  Zij onderzocht drie aspecten van het microgliafenotype en hun functie t: de microgliafenotype diversiteit in verschillende hersengebieden, het microglia fenotype dat betrokken is bij de zenuwvorming (neurogenese) in de hippocampus en het microgliafenotype dat betrokken is bij regeneratieve processen in de hersenen.

Samenvatting proefschrift Marta Olah

proefschrift-110223-olahcover

Wij geven een overzicht van de literatuur betreffend de fenotypediversiteit van microglia cellen in het centra! zenuwstelsel en de functionele betekenis hiervan (Olah et al., 2010). Verder wordt de rol van microglia bij de regulatie van adulte neurogenese in de muis besproken. In deze studie is gebruik gemaakt van een tredmolen. Het is bekend dat fysieke inspanning de neurogenese in de hippocampus versterkt (Salam et al., 2009)

De hippocampale neurogenese

Het eerste onderzoek was gericht op de identificatie van een microgliafenotype dat geinduceerd wordt door interactie met Th2 type T cellen die interleukine-4 produceren (Butovsky et al., 2006). Dit specifike microgliafenotype, dat wordt gekarakteriseerd door expressie van MHCII en van IGF-1, lijkt betrokken te zijn bij de regulatie van hippocampale neurogenese in de muis (Ziv et al., 2006)

Verschiilende aspecten van het microgliafenotype zoals hun morfologie en expressie van specifieke membraan eiwitten zijn onderzocht in muizen met een basale neurogenese (de controlegroep) en muizen die door de beschikbaarheid van een tredmolen veel fysieke inspanning leverden en hierdoor een versterkte neurogenese hadden. Zoals reeds in de literatuur beschreven (van Praag et al., 1999) versterkte een 10-daagse fysieke inspanning de proliferatie van neurale voorlopercellen in de subgranulaire zone van de dentate gyrus, een deel van de hippocampus.

In de hippocampale microglia werd echter noch in controle muizen noch na fysieke inspanning expressie van MHCII en IGF-1 gevonden. Verder werden er in de dentate gyrus van beide groepen muizen bijna geen T cellen aangetroffen. Wel werd er in microglia van controle muizen en na 10-daagse fysieke inspanning expressie van CD45 eiwit (receptor-type tyrosine-proteine fosfatase) aangetroffen, hetgeen een indicatie is voor een milde activatie van de microglia onder beide omstandigheden.

Het is denkbaar dat de microglia, als een vorm van autoregulatie, door expressie van CD45 hun eigen activatie beperken. In vergelijking met controle muizen was na 10-daagse fysieke inspanning het aantal profilerende microglia significant toegenomen. Deze toename werd echter niet alleen in de dentate gyrus, maar ook in het niet neurogene deel van de hippocampus (cornu ammonis) waargenomen, wat suggereert dat dit fenomeen niets met adulte neurogenese te maken heeft.

Op grond van onze experimenten hebben we geconcludeerd dat het microglia fenotype in de neurogene zone van de hippocampus bij zowel basale- als versterkte neurogenese geen aanwijzingen geeft voor interactie met T cellen (Olah et al., 2009). Het is duidelijk dat onze gegevens geen aanwijzingen geven voor de betrokkenheid van interactie tussen microglia en T cellen bij adulte neurogenese. Deze conclusie is belangrijk omdat verondersteld werd dat het bovengenoemde specifieke microglia fenotype een cruciale rol lijkt te spelen bij neurogenese die veroorzaakt wordt door blootstelling aan een verrijkte omgeving (Ziv et al., 2006). Onze studie benadrukt hiermee het belang van het verschil tussen experimentele diermodellen voor het bestuderen van adulte neurogenese.

Microgliafenotypes bij demyelinisering en remyelinisering

Wij onderzochten het microglia fenotype dat aangetroffen wordt bij de- en remyelinisering. Remyelinisering, een regeneratief proces dat bedoeld is de aanleg van myeline rond beschadigde axonen te bevorderen, heeft een complexe en nog niet volledig begrepen relatie met zenuwontsteking (neuroinflammatie) (Hohlfeld, 2007, Ruffini, 2004). Omdat bij multiple sclerosis (MS) de recrutering van endogene oligodendrocytvoorlopercellen naar de beschadigde gebieden geen beperkende factor lijkt te zijn (Wolswijk, 2000; Scolding et al., 1998), wordt gesuggereerd dat het gebrek aan herstel van MS- laesies te wijten is aan gebrek aan ondersteuning van de differentiatie van deze voorlopercellen (Franklin, 2002). Echter de relevante cel- types en factoren die remyelisatie ondersteunen zijn nog niet bekend. Microglia zijn de bewakers van de homeostase van het central zenuwstelsel en staan centraal bij iedere denkbare ontstekingsreactie van het brein en het ruggenmerg (Tambuyzer et al., 2009; Streit et al., 2005).

Wij hebben bij muizen die met cuprizon waren gedemyeliniseerd het microgliafenotype onderzocht dat gevonden wordt bij de- en remyelinisatie. Hierbij zijn acuut geïsoleerde microglia onderzocht op gen-expressie. Het cuprizondemyelinisatiemodel is hiervoor optimaal omdat de bijdrage van perifere immuuncellen in dit proefdiermodel minimaal is (Remington et al., 2007; Matsushima & Morrel, 2001). Hierdoor kan het microgliafenotype goed onderzocht worden. Tot onze verrassing vond er bij het cuprizon model in het corpus callosum tijdens het demyelinisatie en remyelinisatie proces geen verandering van het fenotype plaats bij microglia.

Er ontwikkelde zich gedurende het demyelinisatie process één fenotype dat zich tijdens het remyelinisatie process handhaafde. Op grond van analyse van het gen-expressie profiel van dit fenotype werden diverse processen zoals veranderingen in het lipide metabolisme, verhoogde expressie van het MHCII complex en afwezigheid van expressie van co-stimulatoire stoffen vastgesteld. Verder bleekt het bovengenoemde microgliafenotype in staat tot fagocytose van apoptotische cellen en myeline, en tot recrutering van oligodendrocyt voorlopercellen waarvan ze differentiate ondersteunden. Er moet nog vastgesteld worden of dit microglia fenotype het remyelinisatie process inderdaad actief ondersteunt. Onze gegevens later echter zien dat in tegenstelling tot een vroegere opvatting (Gebicke-Haerter, 2001; Pocock & Liddle, 2001; Banati et al., 1993), microglia-activatie en handhaving van weefselhomeostase in het brein kunnen samengaan. Verder duiden onze bevindingen op de betrokkenheid van microglia bij deelaspecten van het remyelinisatie process zoals de inductie van immuuntolerantie, het opruimen van weefsel debris, weefselherstel, recrutering van endogene neurale voorlopercellen en ondersteuning van de differentiatie van oligodendrocyt voorlopercellen.

Verschil in microgliasamenstelling tussen corpus callosum en cortex

Wij hebben gezocht naar de verschillen in fenotypen van microglia in het corpus callosum (witte stof) en de cerebrale cortex (grijze stof) in het gezonde brein. Er wordt gesuggereerd dat mogelijke regionale verschillen tussen microglia verantwoordelijk zijn voor verschillende vormen van microglia activatie, hetgeen consequenties zou kunnen hebben voor de immuunrespons van het centrale zenuwstelsel (Carson et al., 2007). De twee meest diverse microgliafenotypen zijn gebaseerd op hun morfologie en bevinden zich in witte- en grijze stof. Het neuroinflammatieproces in witte- en grijze stof verschilt aanzienlijk. Zo vertonen MS lesies in grijze stof veel minder microgliaactivatie, complementvorming, beschadiging van de bloed-hersenbarriere en infiltratie van perivasculaire lymfocyten dan in witte stof (Stadelmann et al., 2008; Bo et al., 2006).

We hebben om deze reden het fenotype van acuut geisoleerde microglia uit witte- en grijze stof nauwkeurig geanalyseerd, waarbij gekeken is naar cellulaire morfologie, gen- en proteine expressive en microglia functie. De resultaten suggereren dat het fenotype van microglia uit het corpus callosum verschilt van het fenotype in de cortex. Duidelijke verschillen werden waargenomen in cellulaire morfologie, ATP-geinduceerde calcium fluxen, electrofysiologische membraaneigenschappen en de respons op bacteriele lipopolysacchariden. Verder werden na analyse van genexpressie verschillen gevonden in de expressive van genen die betrokken zijn bij het inflammatie proces. Hierbij moet wel opgemerkt worden dat waargenomen verschillen in genexpressie meer gebaseerd zijn op kwantitieve dan op kwalitatieve verschillen. We konden vroegere suggesties dat microglia in witte stof bij vergelijking met die in grijze stof een grotere mate van activatie hebben noch bevestigen noch afwijzen (Carson et al., 2007). Wel suggereren onze data een complexe relatie tussen de microgliafenotypes in witte en grijze stof en verschillen in functie tussen deze fenotypes.

Snelle methode om microglia te isoleren

Wij beschrijven een snelle en efficiente methode voor de isolatie van microglia uit menselijk weefsel van het centrale zenuwstelsel, verkregen door autopsie of biopsie. Microglia zijn de primaire immuuncellen van het centrale zenuwstelsel en ze zijn betrokken bij zowel handhaving van de homeostase van het centrale zenuwstelsel als bij de immuunrespons bij neuropathologische aandoeningen (Graeber, 2010; Hanisch & Kettenmann, 2007). Er bestaat daarom een toenemende belanstelling voor de eigenschappen en functies van microglia. Tot nu toe bleek het moeilijk om een zuivere populatie microglia uit menselijk hersenweefsel te isoleren. Bij conventionele protocollen moeten uitgebreide celkweek procedures uitgevoerd worden om de zuiverheid de de opbrengst van de geisoleerde microglia te verhogen.

Hierbij wordt het microgliafenotype onvermijdelijk beinvloed door het serum en de groeifactoren die gebruikt worden tijdens de celkweek. Het was daarom onze doelstelling om een verbeterd protocol voor acute isolatie van humane microglia uit hersenweefsel te maken. De vier stappen tellende isolatie procedure (mechanische weefsel dissociatie, verwijdering van myeline, verrijking en verhoging van de zuiverheid) die we beschrijven stelt ons in staat om fenotypes van microglia uit zowel gezond hersenweefsel als hersenweefsel met neurologische aandoeningen te onderzoeken. Opvallend hierbij is dat opbrengst en de zuiverheid van de microglia preparatie nauwelijks beinvloed wordt door de mate van ‘post mortem delay’ en neurologische status. Het protocol kon met succes toegepast worden op glioma biopsie weefsel. Hiermee is het nieuwe isolatie protocol niet alleen snel en eenvoudig maar heeft ook een breed spectrum aan mogelijke applicaties.

Proefschrift: Microglia phenotypes, in CNS plasticity and regeneration
Promotor(s): prof.dr. H.W.G.M. Boddeke
Het onderzoek werd mede gefinancierd door de Stichting MS Research

Curriculum Vitae

Personalia:

Naam:     Marta Olah
Geboren: 7 januari 1979, Szeged Hongarije

 Opleiding:

Neurobiologie aan de Eotvos Lorand University in Budapest, Hongarije

 Werkervaring:

Afdeling Neurowetenschappen, sectie Medische Fysiologie, UMC Groningen
Olah gaat als PostDoc Research Fellow werken in het Brigham and Women’s Hospital in Boston, VS.

Promotie:

RUG 23 februari 2011