Antigeen-presenterende cellen presenteren bij MS op hun oppervlak brokken myeline-eiwit (peptiden) aan het immunologische systeem. Deze peptiden dienen als antigenen bij de immunologische reactie, die de ontstekingen veroorzaakt.Cellen van het immuunsysteem (T-cellen) herkennen en grijpen de antigeen-presenterende cellen. Het resultaat is MS.

b5cproefschrift-080330-kel-cover

Junda Kel probeerde bij muizen EAE (muizen-MS)te veroorzaken. Ze vaccineerde muizen met peptiden van het eiwit myeline uit de beschermende laag van de zenuwbanen. Dat veroorzaakte inderdaad de ziekte. Ze deed het ook met dezelfde peptiden waaraan het suiker mannose was gebonden. Vaccineren met de gemannosyleerde peptiden leidt tot activering en deling van peptide-specifieke T-cellen, die echter niet in staat zijn om EAE te veroorzaken.

Kel beschrijft haar experimenten om meer te weten te komen over de rol van gemannosyleerde peptiden bij de communicatie tussen antigeen-presenterende cellen en T-cellen. Gemannosyleerde peptiden lijken verbetering te brengen in het ziektebeeld van ‘muizen-MS. Voor onderzoek naar de therapie van MS opent dat nieuwe gezichtspunten.

Samenvatting proefschrift Junda Mariska Kel

3edproefschriften-08-03-31-kel-fig1
figuur 1: het centrale zenuwstelsel

Een belangrijk kenmerk van MS ishet ontstaan van verlammingsverschijnselen.De ziekteverschijnselen worden veroorzaakt door complexe processen in de hersenen en het ruggenmerg, waardoor de aansturing (en daardoor het functioneren) van spieren wordt aangetast. De hersenen en het ruggenmerg vormen samen het centrale zenuwstelsel (CZS) en regelen veel functies in het lichaam (figuur 1).

Het CZS bestaat uit zenuwcellen, die met elkaar en met de rest van het lichaam communiceren via elektrische signalen. Zenuwcellen hebben uitlopers, die deze signalen transporteren door het hele lichaam. Zo kunnen vanuit het CZS bijvoorbeeld de spieren worden aangespannen en kunnen we ons bewegen. Zenuwuitlopers zijn soms behoorlijk lang: ze kunnen van de onderkant van het ruggenmerg helemaal tot in de tenen lopen. Om de geleiding van elektrische signalen via zenuwbanen te vergemakkelijken, zijn ze ingepakt in een isolatielaag. Deze laag biedt ook meteen bescherming en heet de myelineschede.

In het CZS van MS-patiënten raakt de myelineschede beschadigd , wat we demyelinisatie noemen (figuur 2). Hierdoor verslechtert de overdracht van elektrische signalen. Soms raken de zenuwuitlopers zelf ook beschadigd. Dit alles leidt er toe dat spieren niet meer goed kunnen worden aangestuurd en er verlammingsverschijnselen optreden. Op meerdere (multiple) plaatsen in het CZS van MS-patiënten zijn zones aanwezig waar demyelinisatie plaatsvindt (zogenaamde laesies), wat uiteindelijk leidt tot de vorming van littekenweefsel (sclerose). Het is niet precies bekend waardoor demyelinisatie ontstaat, maar vanwege de verscheidenheid van symptomen in MS-patiënten wordt gedacht dat er meerdere oorzaken zijn voor het ontstaan van MS. Er zijn veel aanwijzingen dat een verstoorde immuunrespons bijdraagt aan het ziekteverloop in een groot deel van de MS-patiënten.

ce6proefschriften-08-03-31-kel-fig2
figuur 2: demyelinisatie van zenuwuitlopers

Het immuunsysteem

Het immuunsysteem verzorgt de afweer tegen potentiële ziekteverwekkers, zoals bacteriën en virussen. De eerste herkenning van ziektekiemen die het lichaam binnendringen, gebeurt doorantigeen-presenterende cellen. Deze cellen patrouilleren door het lichaam en zijn uitgerust met allerhande receptoren waarmee ze hun omgeving kunnen scannen op de aanwezigheid van ziekteverwekkers.

Sommige receptoren functioneren als ‘grijpers’, waarmee een ziektekiem kan worden opgenomen. Binnen in de antigeen-presenterende cel worden de eiwitten van de ziektekiem in stukjes geknipt, die we peptiden noemen. Vervolgens kunnen al deze peptiden op het oppervlak van de cel worden gepresenteerd met behulp van eiwitten, die fungeren als presenteerblaadjes. Andere immuuncellen zijn in staat om de gepresenteerde peptiden waar te nemen. Een peptide die wordt herkend en een immuunreactie opwekt wordt ook wel een antigeen genoemd; zo komen antigeen-presenterende cellen aan hun naam.

De T-cel is een immuuncel, die in staat is om een peptide op het oppervlak van antigeen-presenterende cellen te herkennen. Het peptide kan alleen worden herkend als het past in de T-cel receptor op het oppervlak van de T-cel. Iedere T-cel heeft slechts één type T-cel receptor op zijn oppervlak, waardoor de specifieke herkenning van één antigeen mogelijk is. Om een zo groot mogelijke hoeveelheid antigenen (afkomstig van ziekteverwekkers) te kunnen herkennen, bevat het immuunsysteem dan ook enorme aantallen T-cellen, die allemaal hun eigen specificiteit hebben.

De herkenning en opname van ziektekiemen leidt tot activatie van antigeen-presenterende cellen, waardoor de presentatie van antigenen verder wordt verhoogd en de productie van signaalstoffen op gang komt. Deze signaalstoffen, in combinatie met het gepresenteerde antigeen, zijn nodig voor de optimale activatie van T-cellen, zodat de ziekteverwekker daadwerkelijk kan worden opgeruimd. Hierbij krijgt de T-cel hulp van andere immuuncellen, zoals B cellen, granulocyten en macrofagen. Dit proces, waarbij immuuncellen elkaar met behulp van signaalstoffen waarschuwen, waarna ze zich verzamelen om ziekteverwekkers op te ruimen, wordt ontsteking genoemd.

Auto-immuniteit in MS

Het immuunsysteem heeft als functie om een ontsteking te veroorzaken als er ziekteverwekkers aanwezig zijn, maar mag niet reageren op lichaamseigen componenten. Als het immuunsysteem niet goed in staat is om dit onderscheid te maken, kan auto-immuniteit ontstaan. Er ontwikkelt zich in dat geval een immuunreactie tegen lichaamseigen structuren, met vaak hele schadelijke gevolgen.

In MS-patiënten is een auto-immuunreactie tegen myeline aan de gang. Per abuis ziet het immuunsysteem myeline als een ‘gevaarlijke component’ en zal proberen om het op te ruimen. Dit leidt tot ontsteking in het CZS, waardoor myeline wordt afgebroken en demyelinisatie optreedt. Gealarmeerde T-cellen, macrofagen en alle ontstekingsfactoren die worden gemaakt, veroorzakenonherstelbare schade aan de myelineschede en de zenuwuitlopers. Hierdoor is het proces van verlamming in MS-patiënten grotendeels onomkeerbaar.

De oorzaak van auto-immuniteit is een verkeerde communicatie tussen antigeen-presenterende cellen en T-cellen. In het geval van MS laat een antigeen presenterende cel ten onrechte aan de T-cel weten dat de gepresenteerde myeline-peptiden ‘gevaarlijk’ zijn, waardoor de T-cel een auto-immuunreactie tegen het eigen lichaam in gang zet. Veel onderzoek heeft dan ook tot doel de communicatie tussen beide celtypes beter te begrijpen. Het corrigeren van de communicatie tussen antigeen-presenterende cellen en T-cellen zou een waardevolle bijdrage kunnen leveren aan de behandeling van patiënten die lijden aan een auto-immuun ziekte. Als lichaamseigen componenten niet langer als ‘gevaarlijk’ worden bestempeld, zal minder ontsteking optreden en zal het ziekteverloop van patiënten verbeteren.

Receptoren op antigeen-presenterende cellen

Ziekteverwekkers hebben specifieke structuren, waardoor het menselijk immuunsysteem ze kan herkennen als lichaamsvreemd. Tot nu toe zijn er twee soorten receptoren bekend die antigeen-presenterende cellen kunnen gebruiken om lichaamsvreemde structuren te onderscheiden.

Ten eerste zijn er Toll-like receptoren, die specifieke structuren van ziektekiemen kunnen herkennen. Binding van ziektekiemen aan Toll-like receptoren leidt tot activatie van antigeen-presenterende cellen en het in gang zetten van een immuunreactie, maar niet tot opname van ziekteverwekkers door de antigeen-presenterende cel.
Daarnaast gebruiken antigeen-presenterende cellen C-type lectinereceptoren om gesuikerde structuren waar te nemen. Veel ziektekiemen hebben gesuikerde structuren op hun oppervlak. De meeste C-type lectinereceptoren fungeren als grijpers en de opname van ziektekiemen draagt bij aan de ontwikkeling van een immuunreactie.

Er zijn echter ook lichaamseigen moleculen die suikers bevatten. Sommige C-type lectinereceptoren blijken juist betrokken te zijn bij het opruimen van dergelijke moleculen wanneer er te veel van aanwezig zijn. In zulke gevallen leidt opname van gesuikerde moleculen uiteraard niet tot een immuunreactie. De reactie van een antigeen-presenterende cel op signalering via de C-type lectinereceptoren is dan ook niet altijd dezelfde. Sommige onderzoeken wijzen uit dat binding van gesuikerde structuren aan C-type lectinereceptoren leidt tot activatie van de antigeen-presenterende cel, waardoor een potente immuunrespons ontstaat. Andere studies laten juist zien dat signalering via C-type lectinereceptoren leidt tot onderdrukking van het immuunsysteem en het ontstaan van immunologische tolerantie.

EAE, MS in muizen

Om meer inzicht te verkrijgen in de ziekteprocessen die mogelijk een rol spelen in MS zijn er modellen in proefdieren ontwikkeld. In muizen kan een MS-achtige ziekte worden opgewekt door ze te injecteren met lichaamseigen myeline-peptide, in combinatie met lichaamsvreemde structuren die kunnen binden aan Toll-like receptoren en dus door antigeen-presenterende cellen als ‘gevaarlijk’ worden bestempeld. Dit wordt immuniseren genoemd. De immunisatie leidt tot alarmering van antigeen-presenterende cellen, terwijl ze het lichaamseigen myeline-peptide aan T-cellen presenteren. Hierdoor wordt een auto-immuun respons tegen myeline in gang gezet en ontwikkelt de ziekte experimentele auto-immuun encephalomyelitis (EAE). Op meerdere plekken in het CZS ontstaan ontstekingen waarin T-cellen en macrofagen een grote rol spelen. Door deze ontsteking raken de muizen verlamd en doen zich dezelfde verschijnselen voor als bij MS-patiënten.

Voor het beantwoorden van de vraagstellingen in dit onderzoek was het niet in alle gevallen mogelijk of noodzakelijk om daadwerkelijk EAE op te wekken in muizen. Daarom zijn tevens zogenaamde ‘vertraagd type overgevoeligheid reacties’ (Delayed Type Hypersensitivity, DTH) gemeten. Na de immunisatie (zie hierboven) wordt een kleine hoeveelheid peptide in het oor van de muis gespoten, waardoor ter plekke een ontstekingsreactie op treedt. Dit wordt een DTH-respons genoemd. Net als EAE is deze immuunreactie afhankelijk van T-cellen en macrofagen. De mate van ontsteking is gemakkelijk waar te nemen aan het oortje, dat rood en dik wordt.

Het promotieonderzoek

Dit proefschrift gaat over het verminderen van auto-immuniteit in EAE, door de communicatie tussen antigeen-presenterende cellen en T-cellen te veranderen. Steeds meer onderzoeken wijzen uit dat signalering via C-type lectinereceptoren op het oppervlak van antigeen-presenterende cellen kan leiden tot onderdrukking van de immuunrespons. Hoe dit gebeurt is nog grotendeels onduidelijk, maar er is wel bekend dat een veranderde communicatie van antigeen-presenterende cellen naar T-cellen een rol speelt.

In dit onderzoek is bestudeerd of gesuikerde structuren die kunnen binden aan C-type lectinereceptoren bruikbaar zijn om de auto-immuunrespons in muizen met EAE te corrigeren. Voor dit doel is gebruik gemaakt van aangepaste myeline-peptiden met twee suikergroepen, namelijkmannoses. Er is bestudeerd of de ontwikkeling van EAE vermindert onder invloed vangemannosyleerde peptiden en hoe T-cellen zich ontwikkelen na herkenning van een gemannosyleerd antigeen.

Tolerantie tegen EAE

Het immuniseren van muizen met een myeline-peptide leidt tot de ontwikkeling van EAE, maar immunisatie met gemannosyleerd myeline-peptide niet. De muizen worden daadwerkelijk tolerant voor het myeline-peptide, want ze zijn vervolgens beschermd tegen EAE-ontwikkeling door her-immunisatie met het normale myeline-peptide. Deze tolerantie is peptide-specifiek, want het is niet mogelijk om tolerantie op te wekken met een willekeurig gemannosyleerde peptide. In de tolerante muizen is er nauwelijks ontsteking in het CZS. Ook de DTH-respons in de oren is verlaagd. Dit betekent dat het immuunsysteem na stimulatie met een gemannosyleerd myeline-peptide niet meer in staat is om een auto-immuunreactie te ontwikkelen. Hierdoor worden het ontstaan van een ontsteking en weefselschade voorkomen.

Verspreiding van gemannosyleerd peptide

Gemannosyleerd myeline-peptide kan worden herkend door C-type lectinereceptoren, maar het normale myeline-peptide uiteraard niet. Dit leidt mogelijk tot een ongelijke distributie van beide peptiden in muizen en het zou een eerste aanwijzing zijn voor een mechanisme dat ten grondslag ligt aan tolerantie tegen EAE. Door het normale myeline-peptide en het gemannosyleerde myeline-peptide te koppelen aan tracers (een soort ‘vlaggetjes’) en vervolgens te injecteren in muizen, is bestudeerd of het gemannosyleerde myeline-peptide in een bepaald orgaan of celtype ophoopt. Hiervoor zijn geen aanwijzingen gevonden.

Tolerantie en interleukine-10

Interleukine-10 is een belangrijke signaalstof binnen het immuunsysteem om de heftigheid van immuunreacties te reguleren. In muizen die geen IL-10 kunnen maken, is dit controlemechanisme afwezig, wat de muizen extra gevoelig maakt voor het ontstaan van heftige ontstekingsreacties.
Om te bestuderen of interleukine-10 een rol speelt in het ontstaan van peptide-specifieke tolerantie tegen EAE, zijn muizen die geen interleukine-10 kunnen maken geïmmuniseerd met gemannosyleerd myeline-peptide. In muizen zonder interleukine-10 is de ontwikkeling van tolerantie tegen EAE even robuust als in normale muizen. Tevens ontwikkelt zich in deze muizen geen DTH-respons. Kortom, interleukine-10 speelt geen rol bij het onderdrukken van auto-immuniteit door gemannosyleerd myeline-peptide.

Het lot van T-cellen

Omdat T-cellen een cruciale rol spelen in de ontwikkeling van EAE en de DTH-respons, hebben we het lot van T-cellen na immunisatie met gemannosyleerd peptide bestudeerd. Daarvoor hebben we gebruik gemaakt van zogenaamde T-cel receptor transgene T-cellen, wat betekent dat álle T-cellen dezelfde T-cel receptor hebben en dus hetzelfde peptide herkennen. Door het grote aantal peptide-specifieke T-cellen is het heel gemakkelijk om te bestuderen wat er met deze T-cellen gebeurt.

Het is gebleken dat de T-cellen geactiveerd raken na herkenning van een gemannosyleerd peptide en dat ze normaal of zelfs iets sneller gaan delen. De T-cellen lijken goed in staat te zijn om signaalstoffen te maken en om zich te verplaatsen. Tot dusver zijn er geen duidelijke aanwijzingen dat de T-cellen verdwijnen of dat ze ongevoelig worden voor stimulatie met het gemannosyleerde peptide. Het blijft vooralsnog onduidelijk waarom grote aantallen peptide-specifieke T-cellen ontstaan, terwijl die niet in staat zijn om een ontsteking in gang te zetten.

Behandeling van bestaande ziekte

Omdat MS-patiënten al ziekteverschijnselen hebben als ze naar de kliniek komen voor behandeling, is bestudeerd of gemannosyleerd myeline-peptide geschikt is om bestaande verlammingsverschijnselen te bestrijden. Hiervoor zijn muizen behandeld met gemannosyleerd myeline-peptide pas ná het ontstaan van EAE symptomen, wat leidt tot een duidelijk aantoonbarevermindering van de ziekteverschijnselen. In het CZS van de behandelde muizen werden veel minder ontstekingscellen aangetroffen, en ook de DTH-respons in deze muizen was aanzienlijk verlaagd. Dit betekent dat gemannosyleerd myeline-peptide gebruikt kan worden om een bestaande auto-immuunreactie te corrigeren.

Conclusie

De resultaten van dit promotieonderzoek laten zien dat gemannosyleerd peptide leidt tot peptide-specifieke tolerantie tegen EAE. Stimulatie met een gemannosyleerd peptide leidt tot activatie en deling van peptide-specifieke T-cellen, die echter niet in staat zijn om ontsteking en weefselschade te veroorzaken. Het is nog onbekend waarom de T-cellen niet in staat zijn om een auto-immuunreactie in gang te zetten. Met het oog op de behandeling van MS-patiënten is duidelijk geworden dat gemannosyleerde peptides bruikbaar zijn om bestaande auto-immuniteit in EAE te verminderen, zodanig dat het ziektebeeld verbetert.

Proefschrift: Mannose-receptor facilitated antigen presentation as an approach to induce tolerance in autoimmune demyelinating disease
Promotor: Prof. dr. F. Koning, LUMC
Dit promotieonderzoek is gesubsidieerd door Stichting MS Research.

Curriculum Vitae

Personalia:

Naam:     Junda Mariska Kel
Geboren: 12 juni 1978 in IJsselstein

 Opleiding:
1990 – 1996 Gymnasiumdiploma aan College De Kolk te Utrecht

1996 – 2001 Universiteit Utrecht, Biologie, specialisatie medische biologie. Tijdens de studie diverse stages waaronder een toxicologisch literatuuronderzoek in opdracht van de Stichting Natuur en Milieu bij de Wetenschapswinkel Biologie van de UU:

Stageperiode bij TNO Voeding in Zeist, afdeling Experimentele Immunologie, een experimenteel onderzoek van een infectiemodel in ratten, voor de bruikbaarheid bijonderzoek naar imuunmodulatie

2002 – 2007 SMBWO Immunologie via ALIFI (onderzoeksschool immunologie)

2002 Stralingshygiëne, niveau 5B

2002 Proefdierkunde, ex. Art. 9

 Werkervaring:
2001 – 2002 – Assistent Projectleider bij TNO Voeding in Zeist, afdeling Experimentele Immunologie. Coördinatie van commerciële onderzoeksprojecten volgens GLP richtlijnen.

2007 – heden – Postdoc onderzoeker binnen de afdeling Celbiologie en Histologie in het AMC, Universiteit van Amsterdam. Onderzoek naar de regulatie van dendritische cellen door TGF-ß en IL-10

Promotie:

2 april 2008, Universiteit van Leiden, afdeling Immunohematologie en Bloedtransfusie (LUMC). Het onderzoek is verrichtin samenwerking met TNO Kwaliteit van Leven in Leiden, divisie Biosciences.