Onderzoek naar de invloed van een aantal chemische bestanddelen in de leefomgeving – de zogeheten extra-cellulaire matrix (ECM) – van oligodendrocyten. Dit zijn cellen in het centrale zenuwstelsel, die de eigenschap bezitten de bij mensen met MS beschadigde myelinelaag rond de zenuwen te kunnen herstellen. Siskova beschrijft de door haar bewezen invloed van de concentratie van enige chemische stoffen in de ECM  op die remyeliniserende eigenschappen. Tegelijk probeert zij een hypothese te onderbouwen over het mechanisme, dat aan haar resultaten ten grondslag ligt.

Samenvatting Proefschrift Zuzana Siskova

19bproefschriftsiskovaVervanging van verdwenen myeline

In de aangetaste gebieden in de hersenen van mensen met MS komen gedemyelininseerde, ofwel ‘kale’, axonen voor, die de oorzaak zijn van ernstig invaliderende symptomen. Net als bij alle andere demyeliniserende afwijkingen kan de definitieve genezing van de ziekte slechts plaatsvinden door de cellen die slecht functioneren te vervangen of te stimuleren. De meeste therapeutische benaderingen richten zich op modulering van het immuunsysteem dat ook nauw betrokken is bij het ontstaan van de ziekte. Deze ‘keuze’ lijkt voornamelijk te worden ingegeven door de nog gebrekkige kennis omtrent celvervangingstherapieën enerzijds en omgevingsfactoren die de celeigenschappen in situ reguleren anderzijds.

Dit geldt ook voor de myelinisatie. In de aangetaste gebieden in het centrale zenuwstelsel (CZS) komen gedemyelininseerde, ofwel ‘kale’, axonen voor, die de oorzaak zijn van ernstig invaliderende symptomen. In het CZS zijn oligodendrocyten (OLG) de enige cellen die in staat zijn om de ‘kale’ axonen te remyeliniseren. Daarom is het van groot belang om de ontwikkeling van OLG goed te karakteriseren evenals alle factoren die de myelinisatie, en in het verlengde daarvan, de remyelinisatie kunnen beïnvloeden, teneinde nieuwe en efficiëntere therapeutische strategieën te ontwikkelen.

Onderzoeksmateriaal

Doel van het in dit proefschrift beschreven onderzoek is de betrokkenheid van bestanddelen van de extracellulaire matrix (ECM) bij de regulering van de differentiatie van de OLG en in het bijzonder van de vorming van de myelinemembraan te onderzoeken. Deze onderwerpen zijn onderzocht in:

  • een uit OLG ontstane cellijn;
  • primaire OLG in celkweek
  • diermodellen en
  • post mortem menselijk hersenweefsel.

Fibronectine remt remyelinisatie

Opvallend is  de aanwezigheid van laminine en fibronectine, twee belangrijke ECM-componenten, in normaal uitziende witte stof  (NWS), in MS-laesies en in lysolecithine-geïnduceerde gedemyeliniseerde laesies in muizen. Onze resultaten laten zien dat terwijl het eiwit laminine (Ln) nodig is voor myelinisatie tijdens de ontwikkeling van het CZS, gedemyeliniseerde laesies juist gekenmerkt worden door hoge concentraties van een ander eiwit, fibronectine (Fn).

Opmerkelijkerwijs verdwijnt Fn uit lysolecithine-geïnduceerde laesies voordat remyelinisatie optreedt. Dit resultaat ondersteunt de theorie dat ondanks de gelijktijdige aanwezigheid van Ln de continue aanwezigheid van Fn in MS laesies de remyelinisatie ernstig belemmert. In vitro, hebben we kunnen aantonen dat zo’n gemengde Fn/Ln-omgeving inderdaad de vorming van myeline voorkomt. Dit versterkt de in vivo waarnemingen en geeft bovendien aan dat Fn de Ln-gemedieerde signalen, die de myelinisatie bevorderen, blokkeert. Astrocyten zijn naar alle waarschijnlijkheid verantwoordelijk voor de ophoping van Fn in de gedemyeliniseerde gebieden.

Deze gegevens geven dus aan dat na demyelinisatie in het CZS de OLG voorlopercellen door de ophoping van Fn wellicht niet een correct, actief remyelinisatie bevorderende signaal-omgeving detecteren. Daardoor wordt de remyelinisatie belemmerd. Het moleculaire mechanisme dat verantwoordelijk is voor de invloed van Fn op het gedrag van OLG voorlopercellen en dat daardoor interfereert met de biogenese van myeline is het onderwerp van de volgende twee hoofdstukken.

Invloed van fibronectine op de ontwikkeling van oligodendorcyten

Wij toonden aan dat veranderingen in de extracellulaire micro-omgeving, met name ophoping van Fn, de biogenese van myeline kan verhinderen doordat het intracellulaire vesiculaire transport van eiwitten die bedoeld zijn als bouwstenen voor de myelineschede wordt veranderd. De gegevens laten zien dat Fn, in tegenstelling tot Ln2, het membraangerichte transport van endogeen NCAM-140 en van het virale eiwit VSV G, twee eiwitten die in  de myelinemembraan terechtkomen, significant remt. Het mechanisme daarachter lijkt te berusten op een integrine-gemedieerde activering van protein kinase C (PKC), wat een stabiele fosforylering van MARCKS tot gevolg heeft. In gefosforyleerde toestand kan MARCKS dynamische veranderingen van het corticale actineskelet teweegbrengen, dat noodzakelijk is voor het richten van het vesiculaire transport naar de myelineschede, wat weer een voorwaarde is voor de morfologische differentiatie van OLG. OLG worden gekenmerkt doordat talrijke uitlopers zich uitstrekken naar de axonen om die te myeliniseren. Om het doelwit te bereiken moeten deze uitlopers hun weg door de ECM ‘hakken’, die de OLG zowel in vitro als in vivo omringt. Matrix metalloproteinasen (MMP) zijn waarschijnlijk betrokken bij dit proces.

Invloed van de chemische samenstelling van de ECM

Wij presenteren het bewijs, dat de moleculaire aard van de ECM de activiteit en localisatie van MMP-9 reguleert en daarmee de uitlopergroei en dus de myelinisatie. Wij namen een afname waar in de groei en vertakkingsgraad van de uitlopers als OLG welke in aanwezigheid van Fn werden gekweekt. Bovendien werd een toename van de MMP-9 activiteit gezien bij van cellen die gekweekt waren in aanwezigheid van Ln2 .. Aan PKC is eerder een rol toegeschreven als potentiële activator van MMP in verscheidene celtypen, en ook in OLG induceert Fn PKC-activatie (zie boven) wat de verhoogde MMP-9 activiteit verklaart.

Het is echter interessant dat, terwijl in aanwezigheid van Fn de MMP-9 activiteit beperkt bleef tot de plasmamembraan van het cellichaam, deze werd gelocaliseerd langs de groeiende uitlopers indien de OLG werden gekweekt in aanwezigheid van Ln2, d.w.z. onder condities die de myelinisatie bevorderen. Het belang van een uitloper-geassocieerde localisatie van MMP-9 onder myeliniserende condities spreekt voor zich, en deze vinding impliceert dat in op Fn gekweekte OLG de uitlopervorming die noodzakelijk is om het doelwit, het axon, door de ECM heen te bereiken zal mislukken, en daardoor ook de myelinisatie.

De rol van complexe gangliosiden

Na de assemblage dient de integriteit van myeline bewaard te blijven. Op grond van talrijke in vivo studies is hierbij een rol voor complexe gangliosiden voorgesteld. De bijbehorende moleculaire mechanismen zijn echter tot nu toe nog niet gevonden. Daarom hebben wij dit onderwerp aangepakt door te onderzoeken of er in vitro een verband bestaat tussen het metabolisme van glycosphingolipiden en myelinisatie.
Wij onderzochten daartoe eerst de gevolgen van het remmen van de de novo biosynthese van glucosylceramide, en daarmee ook gangliosiden, op de integriteit van de myelinemembraan in primaire OLG. Wij deden de intrigerende ontdekking dat onder die condities duidelijke extracellulaire ophopingen ontstaan die voornamelijk bestaan uit galactosylceramide (GalCer), het meest voorkomende galactolipide in myeline. Het is interessant dat wij vergelijkbare extracellulaire ophopingen waarnamen in OLN-93 cellen, die geen complexe gangliosiden bevatten, maar wel een overexpressie van GalCer vertonen.

Dit maakt duidelijk dat een juiste balans tussen complexe gangliosiden en GalCer noodzakelijk is voor het handhaven van de integriteit van de membraan. Inderdaad maakt exogene toevoeging van het ganglioside GT1b aan de cellen dit effect ongedaan, waarschijnlijk doordat het na insertie in de plasmamembraan de juiste (glycosphingo)lipidenbalans herstelt. Voor deze gedachte pleit ook nog dat wij, als we OLG op Ln2, d.w.z. onder myelinisatie-bevorderende condities kweekten, maar niet als dat in aanwezigheid van Fn gebeurde, een toename van de biosynthese van complexe gangliosiden inclusief die van GT1b waarnamen. Een bepaald minimumniveau aan gangliosiden lijkt dus noodzakelijk te zijn om de myelinemembraan te stabiliseren. Deze conclusie stemt overeen met in vivo waarnemingen in ganglioside-nul-mutante dieren: deze blijken een verminderde stabiliteit van hun myeline te hebben die leidt tot een falende myelinecompactie (Kawai et al., 2001; Ma et al., 2003).

Vooruitzichten

De studies die in dit proefschrift beschreven worden laten een zeer complex ECM-geïnduceerd netwerk zien van cellulaire gebeurtenissen die direct of indirect het gedrag van OLG beïnvloeden. In ons werk hebben we ons gericht op de rol van twee belangrijke ECM-eiwitfamilies, laminine en fibronectine.
Het is echter duidelijk dat het onderzoek aan andere ECM-moleculen die na ontsteking van het CZS opgereguleerd worden of opnieuw tot expressie komen net zo relevant zal zijn om een volledig beeld te verkrijgen van de mogelijke veranderingen in de ECM die van belang zijn voor de pathologie van MS. Deze kennis zal cruciaal zijn om de juiste en noodzakelijke doelen te definiëren waarop men zich moet richten bij myelineherstel.

In dit verband zou de activiteit van specifieke MMPs die in staat zijn om alle ECM-moleculen af te breken een interessant doelwit zijn, omdat de activering van specifieke MMPs de eliminatie van ongewenste (ECM) eiwitten die ophopen door de beschadiging of de ontsteking in het CZS en die het myeline-herstel kunnen frustreren zou kunnen bevorderen.

Tot dusver zijn er weinig studies gewijd aan de mogelijke betrokkenheid van veranderingen in de samenstelling van de ECM in diermodellen voor MS. Het knaagdiermodel voor MS, experimentele allergische (of: autoimmuun-) encephalomyelitis, bijvoorbeeld, is tot nu toe voornamelijk gebruikt om de moleculaire mechanismen van de inflammatoire auto-immuunrespons op te helderen. Chemisch geïnduceerde gedemyeliniseerde laesies worden uitgebreid bestudeerd tijdens demyelinisatie-remyelinisatie experimenten maar ontberen ontstekings intermediairen.

Als we met deze nadelen rekening houden kunnen deze modellen niettemin nuttig zijn om myeline-herstel te bestuderen in de context van ophoping en verwijdering van ECM-eiwitten. Het zou in deze modellen bijzonder interessant zijn om de potentiële effecten van specifieke MMPs te bestuderen.

De identificatie van de celtypes die verantwoordelijk zijn voor de productie van ongewenste ECM-moleculen binnen het beschadigde of ontstoken CZS verdient nader onderzoek. Immers, de voorkoming van ophoping van ECM-componenten zou een goede benadering zou zijn om om de remyelinisatiecondities te verbeteren. Op een fundamenteler, celbiologisch niveau zouden de ECM-geïnduceerde moleculaire mechanismen en hun potentiële effect op de differentiatie en het gedrag van OLG voorlopercellen meer licht kunnen werpen op de remyelinisatie-capaciteit van de laesie zelf, wat weer nuttig zou kunnen zijn bij het ontwikkelen van benaderingen die ernaar streven om de ECM-gemedieerde signalen die de (re)myelinisatie remmen te blokkeren.

Proefschrift: Extracellular matrix and (re)myelination
Promotor: Prof. Dr. Dick Hoekstra
Co-promotors: Dr. Wia Baron en Dr. Hans de Vries
De studiereis van Zuzana Siskova naar Canada is gefinancierd door MS Research

Curriculum Vitae

Personalia:

Naam:     Zuzana Siskova
Geboren: 4 april 1979 te Piestany, Slovakije

 Opleiding:
1998-2002 Faculty of Life Sciences, Comenius University, Bratislava, Slovakia (), Department of Molecular Biology and Biotechnology, specilized in Pharmaceutical Biotechnology

 Werkervaring:

During my undergraduate studies I was involved in molecular biology of prion and doppel proteins at the Academy of Slovak Sciences in Bratislava for 2 years. This work resulted in the defence of my master thesis in 2002.

From October same year I have been awarded with Ubbo Emmius scholarship and I have been working on my project “Extracellular matrix and (re)myelination” at the Department of Cell Biology, Medical faculty in Groningen.

During my PhD training I have been awarded with grants from MS foundation and NWO supporting my visit to Canada, where we have established fruitfull collaboration exploring possible mechanisms behind the remyelination failure in Multiple sclerosis from the

perspective of oligodendrocyte differentiation.

5f1proefschriftsiskovaportret

Promotie:

29 november 2006, UMC Groningen

Relatie met MS:

Already during my undergraduate studies I was very much interested in the function of central nervous system and mechanisms behind its degenereation in

particular. Thus this was opportunity to explore this phenomenon closer that I have found very exciting as well as to do my thesis in Holland.