Epigenetische mechanismen

bij differentiatie van neurale stamcellen

Het onderzoek in dit proefschrift heeft zeer belangrijke inzichten opgeleverd in de wijze waarop, met name door epigenetische factoren, de differentiatie van NSCs tot oligodendrocyten gereguleerd wordt; daarnaast hebben de implantatie-experimenten in diermodellen voor MS het opmerkelijke restoratieve vermogen van NSCs, en met name de daaruit gedifferentieerde OPCs, aangetoond en daarmee hun mogelijke klinische potentie voor de benandeling van MS.

Samenvatting proefschrift Sher Falak

De meest invaliderende symptomen in de meer gevorderde stadia van multiple sclerose (MS) worden veroorzaakt door het geheel verloren gaan van axonen en uiteindelijk van de neuronen zelf. Axonale degeneratie treedt niet alleen op in chronische laesies maar lijkt zich ook al voor te doen in vroege acute laesies. Acute laesies in de relapsing-remitting vorm van MS worden veroorzaakt door het binnendringen in het centraal zenuwstelsel van agressieve, reactieve T-cellen die uiteindelijk lokale ontstekingen induceren waarbij allerlei cytokines vrijkomen met als gevolg de beschadiging van myelineVetachtige, witte stof die in de vorm van de zogenaamde myelineschede de zenuwvezels isolerend omhult. De myeline draagt bij tot een efficiënte zenuwgeleiding; bij myelinebeschadiging, zoals bij MS, loopt de zenuwgeleiding mank of is ze zelfs afwezig. Dit kan leiden tot diverse symptomen. Meer... en oligodendrocyten. In de relapsing-remitting vorm van MS zijn deze relapses tijdelijk en na het verdwijnen van de actieve inflammatie kunnen lokale J OPCs (oligodendrocyte precursorcellen) het myeline herstellen en daarmee axonale schade deels te niet doen; in de meeste gevallen is dit echter ontoereikend en worden de gevolgen van axonale beschadiging gecompenseerd doordat parallelle axonale circuits de verloren verbindingen overnemen. Deze plasticiteit van het centraal zenuwstelsel kent zijn grenzen en op een gegeven moment kunnen de gevolgen van axonaal verlies niet langer meer gecompenseerd worden: relapsing-remitting MS gaat dan over in de secondaire progressieve vorm van MS.

Stamcellen ter vervanging beschadigde oligodendrocyten

De huidige therapie voor MS, het voorschrijven van immunomodulerende medicijnen zoals interferon-P, glatiramer acetaat, mitoxantrone of nieuwere zoals natalizumab, is er voornamelijk op gericht om het binnendringen van agressieve T-cellen tegen te gaan, maar deze medicijnen hebben geen enkel effect op het voorkomen of herstellen van axonale schade. Nieuwe efficiënte behandelingen van MS dienen zich daarom ook te richten op het beschermen en herstellen van axonen, direct vanaf de eerste verschijnselen van MS. Er zijn allerlei nieuwe neuro(axo-)protectieve drugs in ontwikkeling die wellicht ook voor MS van belang kunnen worden. De meest effectieve manier om axonen te beschermen is er voor te zorgen dat zij zo snel mogelijk weer geremyeliniseerd worden hetzij door de myelinisatie-activiteit van endogene oligodendrocyten te stimuleren hetzij door het implanteren van nieuwe remyeliniserende of remyelinisatie-stimulerende cellen.
Door het gebrek aan een geschikte bron voor autologe humane myeliniserende cellen is de laatste benadering tot dusverre nooit een reële optie geweest.

De spectaculaire ontdekking dat gewone lichaamscellen gereprogrammeerd kunnen worden tot ES—achtige pluripotente stamcellen (induced pluripotent stem cells of IPS cellen) (Takahashi and Yamanaka, 2006) heeft een nieuwe bron voor eigen neurale stamcellen binnen bereik gebracht en daarmee de ontwikkeling van een remyelinisatie-therapie voor MS-patiënten met behulp van eigen oligodendrocyten nieuw leven ingeblazen.

Opzet van het onderzoek

Dit proefschrift beschrijft onderzoek dat verricht is aan enkele cruciale aspecten van mogelijke klinische toepassing van uit neurale stamcellen (NSC’s) verkregen OPCs. Cruciaal voor veilige toepassing is een gestandaardiseerde complete differentiatie van de NSCs tot functionele OPCs die de eigenschap hebben te migreren naar de te myeliniseren axonen en daar ter plekke ook uitrijpen tot myelinevormende oligodendrocyten. Een dergelijk in-vitro differentiatieprotocol kan slechts betrouwbaar ontwikkeld worden als we volledig inzicht hebben in de moleculaire mechanismen die dit differentiatieproces reguleren. Daarnaast cruciaal voor veilige klinische toepassing is de zekerheid dat de uit de NSCs verkregen oligodendrocyten na implantatie ook stabiel en functioneel blijven en niet bijvoorbeeld weer dedifferentiëren tot een ongedifferentieerd stamceltype.

De twee belangrijkste doelstellingen van dit proefschrift waren:

• Het onderzoeken van de epigenetische regulatie van de differentiatie van neurale stamcellen tot oligodendrocyte precursor cellen (OPCs) d.w.z bestudering van de processen die de ontwikkeling van OPC’s beïnvloeden;
• Het volgen en vastleggen van het lot (overleving, migratie, myelinisatie activiteit etc..) van neurale stamcellen en uit neurale stamcellen verkregen OPCs na intracerebrale implantatie in MS diermodellen met behulp van bioluminiscentie en biofluorescentie in-vivo imaging technieken.

De kennis van de ontwikkeling van stamcellen tot oligodendrocyten

Het eerste hoofdstuk bevat een overzicht over de huidige kennis van oligodendrogenese en bespreekt de belangrijkste intrinsieke en extrinsieke factoren betrokken bij dit proces. Extrinsieke factoren brengen een complexe signaalcascade op gang die de neurale stamcel via een nauwkeurig gereguleerde sequentiële expressie van transcriptiefactoren in verschillende stadia differentieert tot een myeline-vormende oligodendrocyte. De expressie van de transcriptiefactoren en daarmee de selectieve transcriptie van de genen verantwoordelijk voor oligodendrocytevorming wordt gereguleerd via verschillende epigenetische mechanismen, zich uitend in veranderingen in de chromatinestructuur tijdens het differentiatieproces. Covalente enzymatische modificaties van histonen en methylering van DNAafkorting van deoxyribonucleic acid, is een dimere macromolecule dat in levende wezens de drager is van erfelijke informatie. Het bevindt zich in elke celkern. Wordt ook vaak desoxyribonucleïnezuur genoemd. Meer... zijn de belangrijkste epigenetische mechanismen verantwoordelijk voor de structurele veranderingen in chromatine, waarmee de toegankelijkheid van bepaalde gendrager van de informatie voor een specifieke erfelijke eigenschap in een cel. Na de ontdekking van de structuur van het DNA werd 'gen' het woord voor een deel van het DNA-molecuul waaruit een chromosoom bestaat. Tegenwoordig ligt dit nog weer aanzienlijk gecompliceerder. Gen is misschien nog het best op te vatten als een natuurlijke eenheid van erfelijke informatie. Meer... programma’s voor de transcriptiemachinerie bepaald wordt.

Een prominente familie van chromatineremodelerende nucleaire eiwitten is de familie van de polycomb group (PcG) proteins. Deze PcG-eiwitten zijn actief in multimere complexen, zogenaamde polycomb repressive complexes (PRCs), bijv. PRC1 en PRC2. Tijdens embryogenese spelen de PcG-eiwitten een cruciale rol omdat ze ontijdige transcriptie van genprogramma’s onderdrukken en daarmee een normale ontwikkeling van het embryo mogelijk maken. Ezh2, een histone methyltransferase en belangrijkste component van het PRC2 complex, speelt een centrale rol in het onderdrukken van specifieke genexpressie (gene silencing) omdat het na rekrutering naar een bepaald gen, ter plekke het nucleosomale H3K27 trimethyleert en daarmee de rekrutering bewerkstelligt van het PRC1 complex dat verder zorgt voor de stabilisering van genrepressie Een hoge concentratie Ezh2 komt voor in pluripotente embryonale stamcellen, in de meeste kankerstamcellen en in enkele multipotente stamcellen, zoals de haematopoietische stamcellen (Kamminga et al., 2006).

De expressie van Ezh2

Wij begonnen met te onderzoeken of Ezh2 ook in multipotente neurale stamcellen (NSCs) tot expressie komt en konden dat inderdaad in embryonale muizen NSCs aantonen. In lijn met de verwachtingen, gebaseerd op de rol van Ezh2 tijdens de differentiatie van pluripotente stamcellen en kankerstamcellen, werd de expressie van Ezh2 onderdrukt op het moment dat de NSCs differentieerden in astrocyten en neuronen. Echter, de Ezh2-expressie bleef prominent aanwezig tijdens de differentiatie van NSCs tot OPCs en verdween pas op het moment dat die zich differentieerden tot myelinevormende oligodendrocyten. Verstoringen van de normale Ezh2-expressie resulteerden in afwijkingen in het proliferatieprofiel van NSCs en in hun differentiatiepotentiaal. Overexpressie van Ezh2 en onderdrukking ervan in differentiërende NSCs resulteerden, respectievelijk, in een toename en een afname in het aantal oligodendrocyten. Deze bevindingen suggereren de betrokkenheid van Ezh2 in het stimuleren dan wel mogelijk maken van de differentiatie van NSCs tot OPCs en wellicht van hun proliferatie.

Muizen na cuprizondieet

We tonen aan dat Ezh2 ook in de cellen in het adulte muisbrein voorkomt; de toename in het aantal OPCs in het corpus callosum tijdens verhoogde remyelinisatie-activiteit na stopzetten van een cuprizone-dieet in volwassen muizen, ging gepaard met een toename in Ezh2 expressie. Een cuprizondieet is een manier om kunstmatig demyelinisatie bij muizen tot stand te brengen. Om verder de moleculaire mechanismen achter de regulatie door Ezh2 van de differentiatie van NSCs tot OPCs te ontrafelen hebben we met behulp van chromatine-immunoprecipitatie gecombineerd met high-throughput parallelle sequencing (ChIP-Seq), de targetgenen van Ezh2 in kaart gebracht in NSCs en in premyeliniserende oligodendrocyten (pOLs).

Wij vonden dat het merendeel van de Ezh2-targetgenen uniek waren in beide celtypes en dat slechts een zeer klein aantal (29) Ezh2-targetgenen voorkwamen in beide cellen. De overlappende genen betroffen genen betrokken in allerlei basale celprocessen zoals celcyclus voortgang, basaal metabolisme en het (voorkomen van) tumorvorming. De Ezh2-targetgenen in NSCs bleken voornamelijk betrokken bij celcyclusregulatie- en differentiatie processen; de Ezh2-targetgenen in pOLs bleken voornamelijk geassocieerd te zijn met het proces van neuronale en astrocyte differentiatie. Wanneer we de Ezh2-targetgenen deblokkeerden (via silencing van Ezh2 met behulp van RNAi) raakte de proliferatie in NSCs verstoord en vond er geen verdere differentiatie in pOLs plaats; in beide celtypen resulteerde Ezh2-silencing uiteindelijk in apoptosis.

Met behulp van uitgebreide analyses van de lijst met Ezh2¬targetgenen verkregen via Chip-Seq in beide celtypes en verdere validatie experimenten, konden we meer specifiek de targetgenen en de cellulaire pathways identificeren betrokken bij deze processen. In NSCs bleken de belangrijkste genen: Cdkn2a, Tcf21, Six1, Dnmt3a, allen, als algemeen bekend, betrokken bij de controle van de celcyclus en celdood en Gdf6 and Gdf7, subfamilieleden van de TGF-beta superfamilie. In pOLs, bleken de genen coderend voor Wnt (Wnt7b)- en Shh (THM1)-signalering de meest relevante genen in differentiatieregulatie waarvan de expressie via Ezh2 onderdrukt werd. Opmerkelijk genoeg vonden wij tenminste 35 Ezh2 targetgenen in pOLs die op de een of andere manier betrokken waren bij celdoodinductie van pOLs, waaronder bijvoorbeeld Grin2a (NMDR2a/NR2a) en Grin2b (NMDR2a/NR2b). Ezh2-silencing in de pOLs resulteerde in de upregulatie van deze NMDA-receptorsubunits, waarmee hun kwetsbaarheid voor glutamaat-geïnduceerde celdood sterk vergroot werd.

Naast een switch in de Ezh2-targetgenen in de overgang van NSCs naar OPCs, als boven beschreven, vonden wij aanwijzingen dat het PRC2-complex in de pOLs een andere samenstelling heeft dan die van de NSCs, met name wat betreft Suz12 iso-vormen. We laten zien dat de switch in Ezh2-targetgenen tijdens de differentiatie van NSCs tot OPCs en de verandering in het PRC2-complex cruciaal zijn voor de regulatie van dit differentiatiepad en vervolgonderzoek zal moeten ophelderen welke extrinsieke factoren precies (en hoe) deze overgangen op gang brengen. De Ezh2-expressie verdwijnt op het moment dat NSCs differentiëren tot neuronen en astrocyten, in tegenstelling tot oligodendrocyten.

Geforceerde expressie van Ezh2 in astrocyten

Om het belang van deze specifieke Ezh2-downregulatie voor astrocyten differentiatie te onderzoeken, hebben we het Ezh2 geforceerd tot expressie gebracht in postnatale astrocyten Astrocyten waarin Ezh2 tot expressie kwam ondergingen snel karakteristieke veranderingen: zij trokken hun uitlopers terug en kregen het uiterlijk van ronde, prolifererende cellen die in enkele gevallen kleine neurosfeer-achtige clusters vormden. Het expressie profiel van deze cellen toonde een complete downregulatie van typische astrocytegenen en een inductie van de expressie van typische neurale stamcelgenen; de cellen hadden een verhoogde proliferatie activiteit. Een volledige dedifferentiatie naar neurale stamcel vond niet plaats, waarschijnlijk vanwege het feit dat andere PRC2-componenten niet (in dezelfde mate) aanwezig waren als het Ezh2.

De implantatiestudies

NSCs en NSCs getransfecteerd, dwz veranderd door inbrengen van het Olig2 gen (Olig2-tNSCs), waarmee deze cellen geprimed worden tot OPCs, werden stereotactisch geïnjecteerd in het corpus callosum van muizen op een dieet van 0.2% cuprizone ; cuprizone is een koperchelator dat degeneratie van oligodendrocyten induceert en daarmee het verlies van myeline, met name in de corpus callosum. Door gebruik te maken van NSCs geïsoleerd uit transgene muizen, waarin het luciferase-gen was ingebracht onder de controle van de actine promotor, konden wij de cellen in-vivo na implantatie gedurende meer dan 2 maanden volgen met behulp van bioluminiscentie in de IVIS-200. Analyse van de IVIS-200 registraties en immunohistochemische validatie toonden dat ongedifferentieerde NSCs binnen drie weken na implantatie afgebroken en opgeruimd waren terwijl Olig2-tNSCs na twee maanden nog steeds aanwezig bleken; de meeste van deze Olig2-tNSCs hadden zich gedifferentieerd tot oligodendrocyten en droegen bij aan de remyelinisatieHet - gedeeltelijk - terugvormen van een myelineschede om een zenuwvezel, waarvan de myelineschede eerder is verdwenen. Meer... van gedemyeliniseerde axonen in het corpus callosum, zoals bleek uit EM analyses. Met het cuprizone muismodel wordt slechts het demyelinisatie-aspect van MS nagebootst zonder dat ontstekingsverschijnselen optreden.

Implantatie bij muizen met EAE

Een diermodel dat beide aspecten van MS nabootst is experimental autoimmune encephalomyelitis (EAEexperimental autoimmune encephalomyelitis= experimentele auto-immuunontsteking van de myeline in de hersenen, het diermodel van MS. Meer...) en in dit diermodel hebben we NSCs en Olig2-tNSCs op verschillende tijdstippen intraventriculair ingebracht en het lot van deze cellen onderzocht . Als wij deze cellen injecteerden bij de eerste acute fase van EAE of direct bij de eerste verschijnselen van een relaps in chronische EAE (CREAE, hiervoor gebruikten wij Biozzi muizen) bleken NSCs zowel als de Olig2-tNSCs te migreren naar de actieve laesies in het ruggenmerg. Beide celtransplantaties in deze opzet resulteerden in een significante reductie van de klinische verschijnselen. Indien we in CREAE muizen, de cellen injecteerden bij de allereerste verschijnselen van de eerste acute fase bleken NSCs in staat het optreden van een relaps te vertragen, terwijl de Olig2-tNSCs het optreden van een relaps zelfs volledig voorkwamen. De mogelijke klinische implicaties zijn evident en het spreekt voor zich dat de hier aan ten grondslag liggende mechanismen verder onderzocht dienen te worden. Pluchino et al. (2003,2005) hebben eerder aangetoond dat geïnjecteerde NSCs, en wellicht ook onze Olig2-tNSCs, allerlei anti¬inflammatoire en trofische factoren kunnen produceren die bijdragen tot de onderdrukking van klinische symptomen bij EAE. De Olig2-tNSCs, in tegenstelling tot de NSCs, in onze experimenten droegen ook bij aan het remyelinisatieproces met name in de CREAE muizen indien ze vlak voor de relaps werden toegediend; echter vanwege het directe immunomodulerende effect van de geïnjecteerde NSCs was de mate van demyelinisatie en daarmee de behoefte aan remyeliniserende activiteit sterk verminderd.

Conclusie

Concluderend, het onderzoek in dit proefschrift heeft zeer belangrijke inzichten opgeleverd in de wijze waarop, met name door epigenetische factoren, de differentiatie van NSCs tot oligodendrocyten gereguleerd wordt; daarnaast hebben de implantatie-experimenten in diermodellen voor MS het opmerkelijke restoratieve vermogen van NSCs, en met name de daaruit gedifferentieerde OPCs, aangetoond en daarmee hun mogelijke klinische potentie voor de benandeling van MS.

Proefschrift: Differentiation of neural stem cells into oligodendrocytes.
Epigenetic mechanisms & potential applications in multiple sclerosisZiekelijke verharding van weefsel. Bij MS gaat het om de vorming van verspreide harde plekken in hersenen en ruggenmerg. Meer...
Promotor(s): prof.dr. H.W.G.M. Boddeke
Copromotor: Dr.J.C.V.M.Copray
Het onderzoek is gefinancierd door de Stichting MS Research