Mechanistic studies in transgenic immune tolerant mice

Interferon beta, een bekend medicijn tegen multiple sclerose, wordt tegengewerkt door het menselijk immuunsysteem. Dit blokkeert de werking van het medicijn, blijkt uit onderzoek. Promovendus Miranda van Beers toont aan dat de aanwezigheid van eiwitklonten in de medicatie de belangrijkste boosdoeners zijn. Deze kennis is ook van belang voor andere eiwitmedicijnen tegen chronische ziekten.

Samenvatting proefschrift Miranda van Beers

proefschriftbeersRecombinante humane eiwitten vormen tegenwoordig een belangrijke klasse van geneesmiddelen. Recombinant humaan interferon beta (rh1F1\1(3) is één van de therapeutische eiwitten die op dit moment verkrijgbaar zijn. RhIFN13 vermindert het aantal relapses (terugvallen) in de tijd en de hoeveelheid beschadigingen in de hersenen bij relapsing-remitting (intermitterende) vormen van multiple sclerose. Na langdurige behandeling met het medicijn maakt een aanzienlijk deel van de patiënten antistoffen aan tegen het eiwit.

Normaliter begint de immuunreactie met het ontstaan van bindende antistoffen (binding antibodies; BABs) die mogelijk de klaring van het medicijn beïnvloeden, gevolgd door neutraliserende antistoffen (neutralizing antibodies; NABs) die de biologische activiteit van het eiwit aantasten. Men zou een dergelijke immuunreactie niet verwachten, aangezien menselijke eiwitten in principe worden getolereerd door het menselijk immuunsysteem.

Toch treedt deze immunogeniciteit vaak op bij therapeutische eiwitten en verschillende factoren zijn hierbij van belang, zoals de kenmerken van de patiënt, de toedieningsdosis en -route, en de structuur en bereidingswijze van het eiwit. Bovendien wordt gedacht dat eiwitaggregaten (eiwitklonteringen) een belangrijke rol spelen in de immunogeniciteit van rhIFN13. Om de relatie tussen eiwitstructuur en ongewenste immunogeniciteit te onderzoeken, zijn transgene diermodellen ontwikkeld die immuuntolerant zijn voor het eiwit.

Gegevens over antistofvorming

We hebben in de literatuur bestudeerd wat de rol is die aggregaten spelen in de immunogeniciteit van rhIFNj3 bij patiënten met MS. Behandeling van MS patiënten met rhIFN3 kan bindende (BABs) en neutraliserende (NABs) antistoffen opwekken, waarbij laatstgenoemde de therapeutische werking van het eiwit remmen. Het percentage patiënten dat BABs en NABs vormt varieert tussen de verschillende commerciële rhIFNP producten, net als de hoeveelheid antistoffen die de producten opwekken en de tijdsduur die de antistoffen aanwezig blijven. De frequentie van antistoffen tegen rhIFNI3-lb is hoger dan tegen rhIFN13-1a, vermoedelijk als gevolg van verschillen in eiwitstructuur en hoeveelheid aggregaten. Verscheidene aspecten van de immunogeniciteit van rhIFNI3 in patiënten met MS worden besproken, waarbij de bijdrage door aggregaten in het bijzonder wordt uitgelicht.

Transgene muizen op basis van de muisstam C57B1/6 die immuuntolerant zijn voor menselijk interferon beta (hIFNI3) werden eerder toegepast om het verbreken van tolerantie door rhIFNf3 te bestuderen. RhIFN13-1 a producten bereid met humaan serum albumine wekten geen antistoffen op in wildtype C57B1/6 muizen, wat tot de conclusie leidde dat de transgene C57B1/6 muizen niet kunnen worden gebruikt om de immunogeniciteit van dergelijke producten te bestuderen.

Wij hebben daarom een tweede muismodel ontwikkeld door de originele transgene C57B1/6 muizen te kruisen met wildtype FVB/N muizen. Zowel de wildtype als de transgene C57B1/6 x FVB/N hybride nakomelingen zijn vervolgens gebruikt om de immunogeniciteit te testen van drie commerciële producten, Rebif® (rh1FN(3-1a), Avonex® (rhIFNft-la) en Betaferon® (rh1FNft¬lb). Alle producten bleken immunogeen in wildtype hybride muizen, terwijl de immunogeniciteit in transgene hybride muizen afhankelijk was van het product net als in de kliniek. Betaferon® induceerde zowel BABs als NABs in wildtype hybride muizen, echter alleen BABs in transgene hybride muizen. Dit toont aan dat het immuunmechanisme verschilt tussen wildtypen en transgenen. PEG-rhIFNft-la overwon de immuuntolerantie van de transgene hybride muizen niet, wat erop duidt dat pegylering (koppeling van polyethyleenglycol aan het eiwit) geen invloed heeft op het vermogen van rhIFNft-1a om B cel tolerantie te doorbreken. Hieruit kan worden geconcludeerd dat het hybride muismodel unieke mogelijkheden biedt om de immunogeniciteit van een groot aantal rh1F19 preparaten te analyseren, factoren te bestuderen die van belang zijn en het mechanisme te onderzoeken dat verantwoordelijk is voor het doorbreken van immuuntolerantie.

Toepassing van het transgene muismodel

Wij beschrijven studies die gebruik maken van het hybride hIFNft transgene immuuntolerante muismodel, die nieuwe inzichten geven in de immunogeniciteit van rhINft. Wij hebben de fysisch-chemische eigenschappen en de immunogeniciteit van drie verschillende rhIFI\10-1a preparaten bepaald. “Bulk” rhIN11-1 a bestond uit zowel eiwit monomeren als aggregaten die varieerden in grootte van dimeren tot eiwitklonten van enkele micrometers gevormd door niet-covalente bindingen en disulfidebruggen. Ook was een klein aantal covalente aggregaten aanwezig die geen originele epitopen (delen van een eiwit die herkend worden door het immuunsysteem) meer bezaten. Volgens de veranderde wijze bereid rhIFNft-1a (“reformulated”) was hoofdzakelijk aggregaat-vrij op enkele dimeren na die verbonden waren door disulfidebruggen en originele epitopen bezaten. Er werden BABs aangetroffen in ongeveer 40% van de met bulk rhIF1\113-1a behandelde transgene muizen, terwijl reformulated rhIFI\10-1 a geen BABs opwekte in transgene muizen.

Volgens de oude manier bereid (“Stressed”) rhINft-1a liet grote hoeveelheden tamelijk monodisperse, covalente aggregaten zien met een diameter van ongeveer 100 nm. Ondanks het grote aantal aggregaten wekte stressed rhIFNI3-1 a slechts in ongeveer 30% van de transgene muizen antistoffen op, mogelijk omdat de (niet-reduceerbare) covalente aggregaten geen detecteerbare originele epitopen vertoonden. Betaferon®, waarvan bekend is dat het tot 60% grote niet-covalente aggregaten bevat, doorbrak de immuuntolerantie van alle transgene dieren. De resultaten tonen aan dat zowel de aanwezigheid als de eigenschappen van de aggregaten het immunogene vermogen van rhIF1\113 bepalen. In tegenstelling tot de wildtype dieren lieten transgene dieren geen NABs zien en ook reageerden zij niet op een herhaalde blootstelling met reformulated rhIFN[3-1a, wat aangeeft dat het ontstaan van antistoffen niet gepaard gaat met de vorming van immunologisch geheugen.

We behandelden transgene muizen met bulk rhIFN13-1 a en Betaferon®, en daarna opnieuw blootgesteld aan rhIFNI3 door toedienen van Betaferon®. Wederom werd er geen immuunreactie gedetecteerd die kon duiden op immunologisch geheugen. Depletie van CD4+ T cellen verstoorde de immuunreactie tegen Betaferon® in zowel transgene als wildtype muizen. De immuunreactie tegen Betaferon® in transgene muizen immuuntolerant voor hIFNj3 wordt mede mogelijk gemaakt door CD44 T cellen en MZ B cellen maar gaat niet gepaard met een immuunreactie ontleend aan geheugen B cellen.

Een nieuwe bereidingswijze van interferon medicijnen

Wij beschrijvende bereiding, karakterisering en immunogeniciteit van vier verschillende rhIFN13-1 a preparaten. Onbehandeld (bulk) rhIFNI3-1 a werd gedegradeerd door middel van metaal gekatalyseerde oxidatie, waterstofperoxide (H202) gemedieerde oxidatie, en guanidine gemedieerde ontvouwing/hervouwing. Alle preparaten, zowel onbehandeld als gedegradeerd, vertoonden aggregatie en er waren veranderingen te zien in de tertiaire eiwitstructuur van de gedegradeerde producten. De aggregaten in de preparaten vertoonden onderlinge verschillen in (mono-, di- en oligomeer) samenstelling, gemiddelde grootte en mate van covalente ten opzichte van niet-covalente bindingen. Beide oxidatiemethoden resulteerden in aggregaten die opmerkelijk immunogeen waren in transgene muizen en hoge IgG niveaus opwekten vergelijkbaar met Betaferon®. De overige twee geaggregeerde preparaten daarentegen waren nauwelijks immunogeen in transgene muizen ondanks aanzienlijke aggregatie.

Invloed van metaaldeeltjes, glasdeeltjes en nanodeeltjes

Wij bestudeerden de interactie en immunogeniciteit van rhIFNI3-1a met glas- en metaaldeeltjes (microdeeltjes) en polystyreendeeltjes (nanodeeltjes). Incubatie van rhIFN13-la met deeltjes in 100 mM natriumfosfaat buffer en 200 mM natriumchloride (pH 7.2) had tot gevolg dat een aanzienlijke hoeveelheid eiwit adsorbeerde aan alle soorten deeltjes. Nog hogere hoeveelheden adsorbeerden in een buffer met lagere ionische sterkte, namelijk 50 mM natriumfosfaat en 100 mM natriumchloride (pH 7.2). Adsorptie van rhIFNI3-la aan glasdeeltjes resulteerde in een geringe verandering in tertiaire eiwitstructuur, en eiwit desorbeerde gemakkelijker van glas dan van metaal- en polystyreendeeltjes. Incubatie van rhIFN/3-1 a met metalen microdeeltjes veroorzaakte een verhoging van het percentage aggregaten in de niet-geadsorbeerde eiwitfractie. Opmerkelijk genoeg waren met name mengsels van rhIFNI3-1a met metalen microdeeltjes erg immunogeen in transgene muizen, wat kon worden toegeschreven aan de geadsorbeerde eiwitfractie.

Conclusie

Het onderzoek dat in dit proefschrift beschreven wordt heeft geleid tot meer inzicht in het mechanisme waarmee rhIFN13 aggregaten de immuuntolerantie voor het menselijke eiwit doorbreken. Het hybride hIFNI3 transgene immuuntolerante muismodel dat is ontwikkeld bleek een nuttig instrument om de immunogeniciteit van een grote verscheidenheid aan geaggregeerde producten te onderzoeken. Het hybride transgene muismodel maakte het mogelijk om de kenmerken van de immuunreactie geïnduceerd door rhIFNI3 te bestuderen. De resultaten lieten zien dat zowel C134+ T cellen als MZ B cellen betrokken zijn maar NABs en immunologisch geheugen afwezig zijn binnen de tijdsduur van de experimenten. Niet alle aggregaten waren even immunogeen, maar het verwijderen van aggregaten elimineerde de immuunreactie tegen rhIFNI3 in transgene muizen. Geaggregeerde rhIFM3 preparaten die immunogeen waren in transgene muizen bleken eiwitten te bevatten die op het natieve eiwit leken. Bovendien werd aangetoond dat verschillende oxidatiemethoden kunnen leiden tot de vorming van rhIFNI3 aggregaten met sterk verhoogde immunogeniciteit. Ten slotte is duidelijk geworden dat rhIFNI3 gemakkelijk adsorbeert aan gangbare materiaaloppervlakken zoals glas, metaal en polystyreen. Met name complexen van rhIFNI3 met metalen microdeeltj es wekten in hoge mate anti-rhIFNI3 IgG op in transgene muizen, wat het belang benadrukt van het meten en karakteriseren van zichtbare en onzichtbare deeltjes bij de medicijnbereiding.

Proefschrift: Immunogenicity of recombinant interferon beta aggregates;
Mechanistic studies in transgenic immune tolerant mice
Promotor prof. dr. Huub Schellekens, prof. dr. Wim Jiskoot
Copromotor dr. Vera Brinks
De drukkosten van het proefschrift zijn betaald door Stichting MS Research

Curriculum Vitae

Personalia:

Naam:     Miranda M.C. van Beers, ir.dr.
Geboren: Vlijmen, 3 september 1980

 Opleiding:

1998, Stedelijk Gymnasium in ’s-Hertogenbosch

2005, Chemical Engineering and Chemistry at the Eindhoven University of Technology.

 Werkervaring:

graduation project Laboratory of Food Chemistry, Wageningen University;

2006 PhD project under supervision of prof. dr. H. Schellekens (UU) en prof. dr. W. Jiskoot (Leiden University).

January 2011 Research scientist Downstream Processing at the Bioprocessing Technology Institute in Singapore.

proefschrift-110404-mirandavanbeers

Promotie:

4 april 2011, Universiteit Utrecht

Relatie met MS:

Tijdens mijn master studie Scheikundige Technologie kreeg ik steeds meer het idee dat ik mijn kennis graag wilde inzetten om iets te betekenen voor gezondheid en welzijn van mensen. Ook wilde ik graag onderzoek doen, dus mijn promotieproject bleek de ideale combinatie. Ik hoop iets bij te hebben gedragen, ook al is het maar een kleine stap, aan het welzijn van mensen met MS!