‘Klinische betekenis van meting van biomarkers voor ziekteprogressie van MS met behulp van MRI en door bepalingen in lichaamsvloeistoffen’ is de titel van dit proefschrift. Onderzoek naar de mogelijkheid via een meting met MRI of door bepaling van stoffen in het bloed een voorspelling te doen over de te verwachten progressie van de ziekte MS. Meerdere mogelijkheden  zijn reeds beschreven door Michael Khalil in diverse publicaties.

Samenvatting Proefschrift Michael Khalil 

Introductie

proefschrift-120917-khalilcover

Het doel van dit proefschrift is om het klinische nut te evalueren van een aantal biologische markers, gemeten met behulp van MRI en in lichaamsvloeistoffen, voor ziekteprogressie bij multiple sclerose, in het bijzonder in de eerste fase van de ziekte, i.e. in patiënten met een klinisch geïsoleerd syndroom (clinically isolated syndrome (CIS)).

Bevestiging juistheid R2*relaxometrie als methodiek

We wilden ijzerconcentraties te bepalen in verschillende hersengebieden van patiënten met CIS en relapsing remitting multiple sclerosis (RRMS), en daarmee de relatie van deze concentraties onderzoeken met demographische, klinische, en conventionele MRI uitkomstmaten, zoals T2 lesion load, en genormaliseerde hersenvolumes.

Verhoogde ijzerdepositie speelt waarschijnlijk een rol in de pathofysiologie van MS. Echter, eerdere studies naar ijzerdepositie in MS waren met name gebaseerd op visuele analyse van een afname in signaal op T2-gewogen beelden. R2* relaxometry is een methode waarbij de ijzerdepositie kwantitatief bepaald kan worden. We hebben deze methode gebruikt om ijzerconcentraties in de hersenen te quantificeren. In totaal 32 patiënten met CIS en 37 patiënten met RRMS ondergingen een 3T MRI scan en de R2* relaxatiesnelheden werd bepaald in diepe grijze stof-structuren (thalamus, caudate nuclei, putamen, pallidum, hippocampus, amygdala, en nucleus accumbens) en de hersenstam. Basale ganglia R2* relaxatiesnelheden correleerden met een toename in leeftijd (r = 0.3 — 0.6; p < 0.01). RRMS patiënten hadden significant hogere basale ganglia ijzerconcentraties vergeleken met CIS (p < 0.05). Door multivariate lineaire regressie analyse toe te passen, zagen we dat leeftijd, ziekteduur, en grijze stof atrofie onafhankelijke voorspellers voor ijzerdepositie in de putamen waren.

De conclusie was dat kwantitatieve evaluatie met behulp van R2* relaxometry een toename in ijzerdepositie in de basale ganglia in MS patiënten aantoont, wat correleert met de ziekteduur en mate van hersenatrofie. De bepaling van ijzerdepositie met behulp van R2* relaxometry in combinatie met lange termijn klinische en radiologische follow-up is een goede methode om te kijken of ijzerdepositie in de hersenen en rol speelt in de MS pathologie.

Meting ijzerconcentraties in de hersenen en relatie met weefselschade

Naar aanleiding van deze studie, hebben we de ijzerconcentraties in de hersenen in een grotere groep MS patiënten onderzocht met behulp van R2* relaxometry, en we hebben de R2* snelheden in specifieke hersenstructuren van patiënten in verschillende ziekte stadia bepaald en daarnaast in gezonde controlepersonen van dezelfde leeftijd. Naast een gedetaileerd neurologisch onderzoek, ondergingen de patiënten ook neuropsychologische tests zodat we de effecten van ijzerdepositie op klinische uitkomstmaten uitgebreider konden evalueren.

We onderzochten 3T MRI scans van 113 patiënts (35 CIS, 78 MS) en 35 gezonde controles. De ijzerdepositie in subcorticale grijze stof-structuren werd geanalyseerd met behulp van een geautomatiseerde, regiospecifieke berekeningen van de R2″ snelheid. Daarnaast werden er uitgebreide klinische en neuropsychologische uitkomsten verzameld van deze patiënten. We vonden significant verhoogde ijzerdepositie in de basale ganglia van RRMS patiënten vergeleken met CIS patiënten (p < 0.001) en gezonde controles (p < 0.005). Rr snelheden waren gecorreleerd aan leeftijd (r = 0.5, p <0.001), ziekteduur (r = 0.5, p <0.001), EDSS scores (r = 0.3, p <0.005) en met Z-getransformeerde waarden voor cognitieve verwerkingssnelheid (r = —0.3; p <0.01). Vervolgens hebben we stapsgewijze lineaire regressie analyse toegepast om risicofactoren te kunnen identificeren die geassocieerd waren met R2″ levels. De sterkste onafhankelijke voorspeller van basale ganglia R2″ snelheden was grijze stof atrofie (p < 0.001), gevolgd door leeftijd (p < 0.001),en T2-lesie volume (p < 0.005). Het model excludeerde de volgende variabelen: ziekteduur, EDSS en Z-getransformeerde waarden voor cognitieve verwerkingssnelheid.

De conclusie was dat ijzerdepositie in de basale ganglia alleen in latere fases van MS optreedt, en gerelateerd is aan de mate van structurele hersenschade, wat suggereert dat ijzer depositie een epifenomeen is in MS. Bovendien suggereert de afwezigheid van ijzerdepositie in patiënten met CIS ook dat ijzer accumulatie niet voorafgaat een de ontwikkeling van MS.

Cognitieve achteruitgang bij CIS en RRMS

We hebben de mate van cognitieve achteruitgang in relatie to MRI parameters, zoals magnetization transfer (MT) beeldvorming, vergeleken tussen patiënten met CIS en patiënten met RRMS. Cognitieve problemen worden frequent waargenomen in MS en ze zijn gerelateerd aan weefselveranderingen in de hersenen. Echter, tot nu toe was er maar beperkte informatie aanwezig over de mate van cognitieve achteruitgang in de vroegste fase van de ziekte, dus in CIS. Het was ook niet duidelijk of subtiele weefselveranderingen zoals waargenomen op MT imaging een biologische correlaat was van cognitieve dysfunctie. We hebben 44 CIS en 80 RRMS patiënten geïncludeerd.

Alle patiënten ondergingen een korte neuropsychologische test, de ‘Brief Repeatable Battery of Neuropsychological Tests (BRB-N)’en een 3T MRI scan. We vonden vergelijkbare BRB-N subtest resultaten in CIS en RRMS patiënten, waarbij met name de cognitieve verwerkingssnelheid aangedaan was in beide groepen (CIS 13.6%; RRMS 16.3%). Echter, na toepassing van stapsgewijze lineaire regressie om onafhankelijke voorspellers van een verlaagde cognitieve verwerkingssnelheid vast te stellen, kwamen er andere resultaten aan het licht voor CIS en RRMS. Terwijl in RRMS het genormaliseerde cortex volume de sterkste voorspeller van cognitieve verwerkingssnelheid was (p < 0.001), en daarna T2-lesie volume (p < 0.05), was in CIS de corticale MT ratio de enige MRI-parameter die geassocieerd was met afgenomen cognitieve verwerkingssnelheid (p < 0.005).

We concluderen daarom dat cognitieve achteruitgang al in CIS optreedt, met een vergelijkbaar patroon als in RRMS, waarbij een verlaagde cognitieve verwerkingssnelheid het meest vaak voorkwam. Structurele veranderingen in de cortex, zoals waargenomen kan worden met behulp van MT-imaging, kan een biologische substraat voor verlaagde verwerkingsnelheid zijn in CIS, terwijl corticale atrofie en lesie volume waarschijnlijk de biologische substraten voor afgenomen cognitieve verwerkingssnelheid in RRMS zijn.

De epitopen van MOG voor antilichamen

Wij wilden bepalen tegen welke specifieke epitopen op het extracellulaire domein van myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) serum antilichamen in MS patiënten gericht zijn. Deze epitopen zijn mogelijk zeer belangrijk voor autoreactieve antilichamen in RRMS. Het secundaire doel was om te onderzoeken of immunomodulerende behandeling en klinische achteruitgang een invloed hadden op de reactiviteit van antilichamen in MS patienten tegen het MOG-peptide. We hebben hiervoor de reactiviteit van IgG, IgM en IgA immunoglobulines tegen verschillende anti-MOG peptiden bepaald in serum van 28 RRMS patiënten voor en na een jaar behandeling met immunomodulerende therapie. We vonden twee overlappende, immunodominante, lineaire epitopen, te weten de aminozuursequenties 37-48 en 42-53. Recente klinische exacerbaties waren geassocieerd met een significant verhoogde frequentie van immunoreactiviteit tegen de MOG peptiden. Er was geen effect van een jaar lang durende immunomodulerende behandeling op de anti-MOG peptide immunoreactiviteit.

Antilichamen tegen MOG als voorspellers behandeling MS-Schubs

De studie die beschreven staat in Hoofstuk 6 had als doel de voorspellende waarde van serum anti-MOG antilichamen voor behandelingseffect tijdens acute MS Schubs te onderzoeken. We hebben een ELISA assay ontwikkeld om serum IgG en IgM antilichamen die gericht zijn tegen natief gevouwen MOG aan te tonen. Serum monsters werden onderzocht tijdens een remissie voorafgaand aan een Schub (baseline), voorafgaand aan een behandeling met corticosteroiden tijdens een acute Schub, en 6 weken na de behandeling. Anti-MOG IgG concentraties waren significant afgenomen na behandeling met coriticosteroiden, maar dat gold niet voor anti-MOG IgM antilichaam concentraties. Patiënten bij wie de klinische symptomen volledig waren hersteld na een acute MS Schub hadden een significante toename in anti-MOG IgM antilichaam concentraties ten opzichte van concentraties op baseline en tijdens de Schub. De conclusie was dat het meten van anti-natief MOG antilichamen van belang kan zijn voor klinische beslissingen tijdens acute Schubs, met name voor wat betreft de dosis en of duur van behandeling met corticosteroiden of een escalatie-therapie.

SGIII als biomarker voor ziekteprogressie van MS

Wij wilden een nieuwe serum biomarker, een fragment van secretogranine III (SGIII),  valideren als potentiële biomarker voor ziekteprogressie in MS. Deze nieuwe biomarker was recent geïdentificeerd in een studie van onze groep waarin MALDI-TOF- massa spectrometrie was toegepast om biomarkers te identificeren. We hebben serum monsters van 90 MS patiënten (RRMS, n = 50 and primary progressive (PPMS), n = 50) geanalyseerd en van 24 gezonde controles. Om het eiwit aan te tonen hebben we een polyklonaal antilichaam ontwikkeld door immunisatie van konijnen met het SGI II-specifieke peptide Cys-KP GGSQDKSLHNRELSAERPLNEQIAEAEED-A. Alle analyses zijn gedaan met behulp van Western Blot. De aanwezigheid en intensiteit van verschillende banden werd op een semi-kwantitatieve en geblindeerd geëvalueerd, en genormaliseerd met behulp van een referentiemonster. Voor de kwantificatie hebben Odyssey beeldverwerkings-software gebruikt.

De resultaten lieten verschillende SGI II isovormen zien die verschillend tot expressie kwamen in MS patiënts en controles, met name was dat het geval voor de Western Blot banden met de massa van 12 kD, 23 kD, 37 kD en 100 kD (p < 0.01). Patiënten met PPMS hadden een significant sterkere intensiteit van de banden op 37 kD dan de patiënten met RRMS (p < 0.05). Correlatie van de Western Blot resultaten met klinische uitkomstmaten liet zien dat de intensiteit van de band op 37 kD correleerde met fysieke achteruitgang (r=0.238, p<0.05). MS patiënten die onbehandeld waren hadden een hogere intensiteit van de banden op 23 en 100 kD vergeleken met mensen die immunomodulerende therapie ontvangen (p < 0.05). Uit deze eerste validatie kunnen we concluderen dat specifieke isovormen van SGIII bruikbaar kunnen zijn om MS subtypes te onderscheiden, met name de PPMS en RRMS subtypen, en om ziekteprogressie en behandelingseffecten te monitoren.

Bepaling neurofilamenten en NAA als biomarkers

Wij wilden de waarde van een aantal mogelijke biomarkers voor axonale schade in liquor bepalen in patiënten met CIS, en de relatie van deze markers met beschadiging van hersenweefsel, gemeten met behulp van MRI, te onderzoeken. De concentraties van neurofilamenten en N-acetyl aspartaat (NAA) in liquor zijn op dit moment de meest veelbelovende markers om de mate van axonale schade vast te stellen. Daarom hebben we de concentraties van de markers neurofilament zware isovorm (NfH), neurofilament lichte isovorm (NfL) en NAA in liquor geanalyseerd in 67 CIS patiënten en 18 controles met non-inflammatoire neurologische aandoeningen (NC).

De CIS patiënten ondergingen op baseline een MRI met een 3Tesla scanner, met daarnaast sequenties om het T2 lesie volume te analyseren. Bij 21 CIS patiënten was een jaar later het genormaliseerde regiospecifieke en totale hersenvolume nogmaals geanalyseerd. Concentraties van NfL (p <0.001) en NfH (p = 0.05) levels waren significant verhoogd vergeleken met NC. We vonden een sterke correlatie tussen zowel NfH (r = 0.713, p <0.005) als NfL concentraties (r = 0.929, p < 0.001) met leeftijd in de groep van NC. Deze correlatie was zwakker in CIS patiënten voor NfH (r = 0.325, p < 0.01) en afwezig voor NfL. NfH correleerde met fysieke achteruitgang (r = 0.304, p < 0.05) en met verlies van hersenvolume gedurende een jaar (r = —0.518, p < 0.01) in CIS patiënten, maar niet met de verandering in het totale T2 lesie volume.

De conclusie was dat onze bevindingen bewijs leveren dat verhoging in concentraties van neurofilamenten reeds in de vroegste stadia van MS plaatsvinden. De correlatie van de NfH concentratie met klinische achteruitgang en afname in hersenvolume, maar niet met verandering in lesie volume ondersteunt het idee dat deze markers geassocieerd zijn aan axonale schade.

NCAM als biomarker

Wij bestudeerden of de liquor concentraties van neural cell adhesion molecule (NCAM) als biomarker in de klinische praktijk kan dienen in patiënten met CIS en MS. NCAM speelt een centrale rol in neuronaal herstel en regeneratie. Verlaagde concentraties van NCAM in liquor waren waargenomen in een MS patiënten in een studie met een beperkt aantal MS patiënten, en een geleidelijke toename werd gezien in MS patiënten in een relapse die een klinische verbetering lieten zien na een immunomodulerende behandeling.

Echter, tot nu toe was het onduidelijk of oplosbaar NCAM ook gecorreleerd was aan klinische en MRI uitkomstmaten in CIS en MS. Daarom hebben we NCAM concentraties geanalyseerd in liquor van 85 patiënten (CIS n = 66; MS n =19). Patiënten ondergingen een gedetailleerd klinisch onderzoek en een 3T MRI scan. Een follow-up MRI scan na gemiddeld één jaar was verkregen van 32 patiënten. Liquor monsters van 17 patiënten met andere neurologische aandoeningen dienden als controles. De NCAM concentraties waren vergelijkbaar tussen CIS en MS patiënten samen ten opzichte van de controles. De resultaten lieten zien dat NCAM concentraties in liquor van RRMS patiënten significant lager waren dan in CIS patiënten (p = 0.05) en ook lager in patiënten met klinische exacerbatie (Schub) vergeleken met patiënten in een stabiele fase (p < 0.05). Hogere concentraties van NCAM in liquor correleerden met het totale weefselverlies in de hersenen, en in de grijze stof en de cortex, over een periode van een jaar (r = —0,4 tot -0,6; p < 0.05 — p < 0.005). De conclusie was dat NCAM is veranderd in liquor van MS patiënten afhankelijk van de fase en activiteit van de ziekte. NCAM concentraties kunnen toenemen tijdens regeneratie, wat waarschijnlijk alleen op korte termijn gunstige effecten op weefselverlies heeft, gezien de correlatie met weefselverlies op lange termijn. Echter, een verlaagde NCAM concentratie kan ook bewijs zijn voor een actiever ziektebeloop. Er zijn aanvullende studies nodig om de relatie tussen NCAM concentraties in liquor en moderne MRI uitkomstmaten te onderzoeken, zoals MTI of meer gedetailleerd analyses van de hersenstructuren.

Conclusies

We concluderen dat de resultaten van dit proefschrift tot verschillende nieuwe inzichten hebben geleid voor de betekenis van biomarkers op MRI en in lichaamsvloeistoffen in MS, met name voor de vroegste fase van de ziekte, CIS.

Het gebruik van onconventionele MRI-technieken, zoals R2* relaxometry om ijzer in hersenen te kwantificeren en MTI om hersenweefselschade vast te stellen, biedt nieuwe mogelijkheden om markers voor ziekte progressie te identificeren. De relatie R2* relaxometry met weefselschade suggereert dat deze ijzer detectiemethode potentieel gebruikt kan worden als marker voor neurodegeneratie in MS. Corticale MTI kan gebruikt worden om vroege weefselveranderingen die gerelateerd zijn aan verslaagde cognitieve verwerkingssnelheid te detecteren in patiënten met CIS.

Nieuwe kandidaat biomarkers voor ziekteprogressie in lichaamsvloeistoffen, zoals secretogranin III, zullen verder gevalideerd moeten worden in grote MS cohorten. We hebben laten zien dat serum antilichamen tegen MOG peptiden en natief gevouwen MOG een reflectie kunnen geven van ziekteactiviteit en —progressie in MS. Echter, recente studies laten zien dat antilichamen tegen het natieve, membraangebonden en geglycosyleerd MOG relevanter zijn in kinderen met acute disseminated encephalomyelitis. Neurofilamenten in liquor zijn betrouwbare markers om de mate van axonale schade in OS en MS aan te tonen en kunnen daarom waarde hebben om in toekomstige studies het klinische beloop en behandelingseffectiviteit vast te stellen.

Tenslotte

Tot slot ondersteunen de resultaten uit dit proefschrift het idee dat een gecombineerde aanpak, waarbij zowel biochemische en kwantitatieve MRI maten samen met verbeterde klinische uitkomstparameters gebruikt worden, een belangrijke stap vooruit vormt om axonale schade en neuronaal herstel vast te stellen in de vroegste fase van MS.

Proefschrift: Clinical significance of MRI and body fluid markers for disease progression in MS
Promotoren: prof.dr. M.A. Blankenstein en prof.dr. F. Fazekas

Stichting MS Research droeg financieel bij aan het tot stand komen van dit proefschrift

Curriculum Vitae

Personalia:

Naam:     Michael Khalil
Geboren: 12 februari 1974

 Opleiding:

Universiteit Innsbruck

 Werkervaring:

vanaf 2001 tot 2006 bij onderzoeksgroepen in Innsbruck en vanaf 2006 tot heden bij de universiteit van Graz. In de jaren 2010- 2011vooral werkzaam bij de afdeling klinische chemie van de Vrije Universiteit in Amsterdam.

Promotie:

17 september 2012 aan de Vrije Universiteit in Amsterdam